p120-catenin在脑缺血再灌注损伤后炎症反应中的作用和机制研究

The topic will establish focal cerebral ischemia and reperfusion injury model in mice by using the middle cerebral artery occlusion method as well as mouse brain microvascular endothelial cells and microglia of ischemia and re-reperfusion injury model through the cellular oxygen-glucose deprivation. Respectively, application of gene silencing and gene overexpression to suppress or increase the p120 gene expression, through behavior, morphology, molecular biology, immunofluorescence cofocal image and immunoprecipitation methods, we deeply explore p120 dynamic changes after cerebral ischemia and reperfusion injury to clarify the protective effect of p120 on inflammation by negatively regulate TLR4 signaling pathway, in-depth to investigate the cell signal transduction pathways of the regulation of p120 expression which is proved related to the TLR4 and calpain protein kinase activity. Ultimately, make clear that the roles and mechanisms of p120 in cerebral ischemia and reperfusion injury induced inflammation, which will enrich molecular biological mechanisms of cerebral ischemia and reperfusion injury, and provide the new target for prevention and treatment of ischemic cerebrovascular disease drugs, which has important theoretical significance and application value.

本课题拟采用大脑中动脉阻塞法建立小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，并通过细胞糖氧剥夺法建立小鼠脑微血管内皮细胞和小胶质细胞缺血（氧）再灌注损伤模型，分别应用基因沉默和基因过表达技术抑制或增加p120的基因表达，通过行为学、形态学、分子生物学、免疫荧光共聚焦、免疫沉淀等方法，深入探讨脑缺血再灌注损伤后p120的动态变化，阐明其对脑缺血再灌注损伤后炎症的保护作用是通过负向调控TLR4信号通路实现的，深入研究调控p120表达水平的相关细胞信号转导途径，证明与TLR-4及Calpain蛋白激酶的活性有关。最终达到明确p120在脑缺血再灌注损伤后炎症反应中的作用和作用机制的目的，充实和完善脑缺血再灌注损伤的分子生物学机制，并为研究防治缺血性脑血管疾病的药物提供新的作用靶点，具有重要的理论意义和应用价值。

缺血性脑血管疾病发病机制复杂，脑缺血再灌注后局部过度的炎症反应和细胞凋亡是造成脑组织损伤的主要原因。p120-catenin是犰狳重复序列蛋白家族的重要新成员，近年来，有研究表明，p120参与负向调节炎症反应及具有潜在的抑制细胞凋亡的作用，但对其机制的研究很少，p120是否在缺血性脑血管疾病中发挥作用，特别是其介导细胞粘附以外的功能在调节脑缺血再灌注损伤后炎症反应和细胞凋亡中的作用国内外尚未见报道。本课题采用大脑中动脉阻塞法建立局灶性脑缺血及再灌注损伤模型，并通过细胞糖氧剥夺法建立脑皮层神经元和脑微血管内皮细胞缺血及再灌注损伤模型，体内外分别应用慢病毒转染方法，过表达和shRNA基因沉默调控p120的蛋白表达。通过行为学、形态学、分子生物学、免疫组织化学、流式细胞术等方法，探索了p120在脑缺血再灌注损伤中的保护作用及其调控机制。结果显示，脑缺血再灌注损伤后，p120基因沉默小鼠与野生型小鼠相比其缺血后脑损伤明显加重，炎症细胞的浸润增多，炎症因子的表达升高，神经元细胞凋亡增多。在原代培养神经元细胞和脑微血管内皮细胞的机制探索中发现，p120对脑缺血再灌注损伤后炎症的保护作用和凋亡抑制作用是通过负向调控TLRs信号通路实现的。另外，本课题初步探讨了p120表达水平与TLRs和蛋白激酶Calpain的活性有关。因此，本课题首次揭示了p120在脑缺血再灌注损伤中的生物学作用及分子机制，并对调控其表达的机制做了初步研究，为疾病的防治筛选新的靶点，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。