OCT4及Sox2抗原特异性CTL靶向杀灭耐药性肺癌干细胞的实验研究

Drug therapy including chemotherapy and EGFR-targeted therapy plays an important role in the treatment of lung cancer. However, the treatment failure is usually due to the development of drug resistance. Increasing evidence suggests that cancer stem cell (CSC) in solid tumors is one of the main causes for drug resistance. We previously studied on high expression of pluripotency factors including OCT4 and Sox2 in Lung CSCs, and found the existence of Lung CSCs is an independent risk factor for prognosis. Therefore, we hypothesize that targeting drug-resistant lung CSCs will be a breakthrough in solving problem of drug resistance. In this study we plan to amplify OCT4/Sox2-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs), and investigate their therapeutic effects in vitro by treating drug-resistant lung CSCs with OCT4/Sox2-CTL alone or with a combination of OCT4/Sox2-CTL and PD-1 inhibitor. Furthermore, we will also assess in-vivo effects of CTL-based immunotherapy on survival of both in situ and metastasis model mice of drug-resistant lung cancer, in order to reveal the importance of targeting drug-resistant CSC and provide a rationale for clinical application of combinational immunotherapy in treating lung cancer.

肺癌临床治疗中，药物治疗（包括化疗及EGFR靶向治疗）占据着重要地位。但癌细胞的耐药与否往往是决定治疗成败的关键。研究表明肿瘤干细胞（CSC）是引起肿瘤耐药的主要根源之一。在前期研究中，我们对耐药肺癌CSC所表达的OCT4及Sox2等多潜能因子进行研究，发现肺癌原发病灶中存在此类癌细胞是威胁患者生存的重要独立预后风险因子。综上，我们推测靶向杀灭耐药性CSC，是突破目前肺癌耐药的一种有效策略。据此，本课题选择OCT4、Sox2等肺癌CSC标志，采用自主创建的抗原特异性细胞毒T细胞（CTL）体外培养扩增新技术，探索OCT4/Sox2-特异性CTL单独或与PD-1抗体结合对耐药肺癌CSC的体外杀伤效应。通过应用耐药肺癌原位模型和转移模型，评估CTL免疫治疗的体内疗效及其对荷瘤小鼠生存的影响，以期揭示靶向杀灭耐药性CSC对治疗肺癌的重要意义，为今后的临床实践提供理论指导及实验依据。

肺癌对化疗或靶向药物耐药最终导致复发转移是导致患者死亡的主要原因。肺癌耐药其原因之一是肿瘤组织中存在少量的肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）。前期研究发现干细胞重要转录因子OCT4及Sox2等的高表达与患者预后呈明显负相关。CSC的存在是肺癌复发、转移及耐药的根源。因此如何有效抑制和杀伤CSC是今后包括免疫治疗在内的肿瘤治疗的一个重要方向。因此，本项目探讨了针对这些高表达Oct4、Sox2的CSC进行免疫治疗的新方法。.本项目用Oct4和Sox2抗原肽孵育来自肺癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)。以CD154慢病毒转染制备的CD154(+)NIH3T3细胞作为饲养层，激活从PBMCs获得的原代B细胞[CD19(+)]。将活化的B细胞与CTLs共培养，制备Oct4和Sox2抗原肽。采用CFSE标记靶细胞，流式细胞术检测CTLs对CSCs的杀伤作用。在acDC检测后，PBMCs在CD8(+)/CD3(+)细胞群中显著增加(p<0.01)，表明成功制备了CTL。在CD154(+)NIH3T3饲养层上培养的原代B细胞导致表达CD80、CD86或HLA-A的群体比例显著增加(p<0.01)，表明B细胞激活成功。利用球体培养及磁性分选方法分离CSCs，免疫荧光证实其表达Oct4和Sox2。体外实验表明，CD154激活的B淋巴细胞对Oct4和Sox2肽抗原提呈增强了CD8(+)CTL对CSC的杀伤作用。与对照组相比， Oct4/Sox2特异性CTL及联合PD-1抑制剂对CSCs的杀伤作用明显增强。因此， Oct4/Sox2特异性CTL对CSCs具有有效的杀伤作用。.此外，通过将CSCs注射到SD小鼠的左肺，构建DRLC小鼠。研究显示，Oct4/Sox2特异性CTLs和PD-1抑制剂联合处理，其对CSCs有较高的细胞毒性，证实PD-1抑制剂对Oct4/Sox2特异性CTLs有较好的协同杀伤作用。体内实验也证实，OCT4&SOX2 CTLs联合PD-1抑制剂可有效抑制肿瘤生长，使小鼠体内的肿瘤体积和重量减少。因此，OCT4&SOX2 CTLs 联合PD-1抑制剂不仅可有效协同杀伤耐药CSCs，且可有效抑制小鼠体内耐药肿瘤的生长。.本项目虽为基础研究，但研究内容源于临床实践，研究结果将为干细胞抗原特异性CTL在临床应用的价值和前景提供重要的理论和实践依据。