新型聚合物凝胶改善毛细管电泳-单链构象多态性技术分离性能的研究

Sieving matrix plays an important role in the technology of capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism (CE-SSCP). This program is going to study the sieving properties of a novel sieving matrix named Tetra-PEG gel. The goal of this program is to achieve a new CE-SSCP method with higher resolution, faster speed and easier feasibility, with the proper usage of Tetra-PEG gel. The content of this program contains: (1) to study the migration behavior of single strand conformation polymorphism DNAs with various concentrations and molecular weights of Tetra-PEG gels, pH, buffer additives mutation site, length of DNA, GC-content, etc, (2) to reveal the mechanism of SSCP separation in Tetra-PEG gels and the separation performance of CE-SSCP using Tetra-PEG gels, and (3) to study the serotyping method for 6A and 6B Streptococcus Pneumoniae using Tetra-PEG based CE-SSCP technology. This edge cutting research is of great importance in the mechanism of molecular sieving. The content of this research will improve the performance of CE-SSCP technology, which has scientific importance to the study and application of molecular diagnosis.

筛分介质是影响毛细管电泳-单链构象多态性（CE-SSCP）分离性能的主要因素。研究表明，新型的聚合物凝胶——Tetra-PEG凝胶——具有高度均一的纳米结构，研究价值很高。本项目利用该凝胶，探索构象异构的DNA分子的电泳迁移机制，开发提高CE-SSCP分离性能的新技术，主要工作有（1）研究Tetra-PEG凝胶的浓度和分子量、pH值、添加剂、DNA突变位置、DNA长度、碱基含量等因素对构象异构DNA分子电泳迁移行为的影响；（2）阐明前述因素对构象异构DNA分子迁移行为的作用机制；探索Tetra-PEG凝胶作为筛分介质时，CE-SSCP的分离性能；（3）利用所研成果指导肺炎链球菌血清型6A和6B的高效CE-SSCP分型方法。该项目的顺利开展为扩展分子筛分机制的理论体系和改善CE-SSCP技术的分离能力提供实验和理论依据，对分子诊断学的理论研究和临床应用均具有重要科学意义。

分子筛分机制是电泳分离大分子的一种方法。其原理是利用筛分介质微观的聚合物网络，将大分子按照分子量大小分离。自然界中存在大量单链构象多态性分子，其大小会因构象差异而不同。目前，分离单链构象多态性分子的分离技术仍需改善。本研究以DNA为标准样品，研究了两种新型分子筛分介质，报道其分子筛分性能；开发毛细管电泳荧光检测系统，用于分子筛分机制的研究。虽尚未实现单链构象多态性分子的筛分，但有望继续开发此方面的应用。.Tetra-PEG（polyethylene glycol）水凝胶因其形成的聚合物网络结构缺陷少，有望抑制电泳条带扩散、提高分离性能而被选为研究对象。研究证明tetra-PEG凝胶毛细管能够实现标准样品的有效分离。将tetra-PEG凝胶毛细管应用于单链构象多态性分子的检测，实验发现标准样品的荧光信号难以被检测到。为探索其原因，本项目开发荧光检测系统，用于实时观测电泳条带的荧光强度变化情况。.传统毛细管电泳荧光检测系统将检测窗口近似为一个理想的点光源。本项目开发的荧光检测系统利用成像系统，收集检测窗口的图像，将检测窗口模拟为一维线光源，以便实时监控电泳条带的亮度在随时间的变化情况。利用该系统，发现小DNA分子在电泳过程中更易扩散，严重者，其荧光信号淹没于背景噪音中。本研究采用长度仅为21 nt的单链DNA，由此推断，扩散现象或是单链构象多态性分子的荧光信号无法探测的主要原因。利用该系统，本项目还提出了一种高精度的定量毛细管电泳检测方法，该成果发表于Sensors and Actuators B期刊。.本项目自主研发的筛分介质为PEGDA（polyethene glycol diacrylate）和PEGA（polyethene glycol acrylate）的共聚物水凝胶，亦称copoly(PEGDA/PEGA)水凝胶。该凝胶因其交联剂PEGDA具有较高的水溶性，能较大范围地调整聚合物网络的孔径。实验结果表明，当保持PEGDA和PEGA总浓度不变，单纯改变PEGDA/PEGA的比例（即网络孔径的交联程度）便可调控分离能力，可获取优异的分离技术。该研究成果发表于ACS Applied Polymer Materials 期刊。由于该水凝胶具有高调控性，若对其成分加以合理优化，有望合理抑制小DNA电泳条带的扩散，实现单链构象多态性分子的筛分。