基于AMPK/mTOR通路的围产期肉牛外周雌激素的PMNs活性调控机制研究

Perinatal health is the key to guarantee a high efficient reproduction of female cattle. A scientific evaluation of perinatal immune state and revelation of the regulation mechanism of physiological factors on immune state, are crucial to develop a precise and efficient nutrition and management strategy for improving perinatal health and promoting high efficient reproduction. Transient immune suppression of peripheral blood neutrophils (PMNs) is one of the significant feature of immune dysfunction, estrogen (E) specifically involves in the process of cellular energy metabolism by which determine PMNs function. However it remains unclear the expression profile of the specific estrogen nuclear/membrane receptors (nERs/mERs) and the signaling mechanism of cellular energy metabolism mediated by nERs/mERs in PMNs. This project select Angus cattle, use the fluorescence quantitative RT-PCR, western blot and immunofluorescence method to analyze the expression of ERs and the expression and activation of "switch" of cellular energy metabolism -AMPK/mTOR signaling pathway related signals in PMNs of perinatal, ovariectomy-E-administrated and E-induced in vitro. The expected result can elucidate the regulation and signaling mechanism of PMNs function from cellular energy metabolism which regulated by E via nERs/mERs, and provide a scientific evidence for developing the perinatal immune status evaluation -based, precise, efficient nutrition strategy for female beef cattle.

围产期健康是保障母牛高效繁殖的关键，科学评价围产期母牛免疫状态、揭示生理诱因调节免疫状态的信号机制，对于制定精准高效的营养与管理策略以提升围产母牛健康水平、促进高效繁殖至关重要。外周血中性粒细胞（PMNs）活性抑制是围产牛免疫机能障碍的显著特征，雌激素（E）可以特异性调节决定PMNs活性的细胞能量代谢过程，但牛PMNs的E特异性核/膜受体（nERs/mERs）表达特征及其介导细胞能量代谢的信号机制尚不明晰。本项目拟以安格斯肉牛为研究对象，采用qPCR、Western blot和细胞免疫荧光技术，通过分析围产牛、E注射卵巢摘除牛和E体外诱导“三种背景下”PMNs的ERs表达特征、细胞能量代谢“开关”—AMPK/mTOR通路信号表达与活化状态，以期从细胞能量代谢角度阐释围产期外周E 的PMNs免疫活性调节效应及信号机制，从而为制定基于肉用母牛围产期免疫状态评价的精准高效的营养策略提供科学依据。

中性粒细胞（PMN）功能障碍是围产期母牛疾病易感性升高的重要内因，而性类固醇激素状态和负能量平衡（NEB）是PMN功能障碍的两大重要诱因。临床研究发现，牛围产期外周血E2水平过高或过低均会引起PMN糖代谢紊乱，使PMN免疫功能下降，从而增加发生子宫炎、子宫内膜炎和乳腺炎的风险。深入探究E2调节PMN糖代谢的机制及其与细胞外环境能量状态的关联，有利于阐明牛围产期免疫功能障碍的本质和制定可行的相关疾病防控策略。.主要研究内容：（1）确证了LPS诱导激活PMN依赖AMPK/mTOR信号通路和TLR2/TLR4-MyD88-p65信号通路，而以AMPK磷酸化水平为标志的细胞能量代谢状态的改变是PMN免疫活性变化的基础，TLR2/TLR4-MyD88-p65可作为评价PMN免疫应答的特征信号。（2）证明了ERS（ERα、ERβ 、GPR30）的E2浓度依赖性表达特征及细胞调节效应差异性特征，并且E2依赖ERα和GPR30具有提高细胞炎性反应潜能而非诱导炎性反应。低浓度E2 通过增强GPR30表达，下调炎性信号反应、维持AMPK磷酸化水平、降低mTOR磷酸化水平，以维持细胞分解代谢抑制合成代谢，从而抑制炎性反应; 高浓度E2可通过ERα、GPR30途径促进AMPK磷酸化、抑制mTOR磷酸化、增强炎性信号反应，以增强细胞能量代谢为基础提高炎性反应能力；同时E2在影响TNFα、IL-6IL-1β、IL-10 基因表达与释放及p65活化上具有显著浓度依赖性差异。（3）通过分析PMN糖代谢关键酶HK、GSK-3β、PFK1、G6PDH活性，糖原含量，细胞ATP稳态，葡萄糖转运蛋白GLUT1、GLUT4、 SGLT1表达，自噬蛋白Atg5、Beclin1、LC3、p62表达及细胞凋亡状况，发现环境葡萄糖缺乏状态下，E2可通过显著增强糖摄入、抑制糖分解、增强自噬等途径增加糖原累积，从而抑制细胞凋亡，维持PMN活力和免疫反应潜能。.本项目围绕AMPK/mTOR 信号通路开展牛PMN开展E2浓度、能量水平与PMN免疫功能内在联系的研究，有关成果将为阐释牛围产期PMN免疫抑制发生发展机理提供新的理论依据，也可为制定临床干预手段提供有益参考。