围产期科尔沁黄牛外周血免疫细胞HSP70表达与生理应激耐受性的研究

采集围产期科尔沁黄牛外周血，分离血浆、淋巴细胞和嗜中性粒细胞。用RIA法测定糖皮质激素、雌二醇和孕酮浓度，以确定生理应激强度。用流式细胞仪分析免疫细胞/亚类动态变化（抗牛单克隆抗体标记，嗜中性粒细胞瑞士染色光镜计数）、PCD状况（AnnexinV/PI染色），并定量检测细胞内ROS浓度（荧光分光光度法）和血浆ROS浓度（MDA法），以确定应激对免疫细胞动态变化及状态的影响。定量检测HSP70mRNA丰度（荧光定量RT-PCR法）和淋巴细胞、嗜中性粒细胞及血中HSP70浓度（2D-SDS-PAGE电泳），以评价细胞的应激耐受性。通过激素应激条件下免疫细胞的动态变化及PCD状态，阐明HSP70mRNA转录和HSP70表达模式与上述指标的内在联系，从而揭示围产期科尔沁黄牛的生理应激耐受性的大小及种群/个体差异，为围产期免疫调控、疾病控制及利用HSP70基因选育抗应激种群提供借鉴和新思路。

科尔沁黄牛是以地方品种—蒙古牛为母本、西门塔尔牛为父本杂交选育的兼用品种，具有良好的繁殖性能、生产性能和适应性，广泛分布于内蒙古东部以及黑、吉、辽毗邻地区。但目前在科尔沁黄牛围产期的繁殖生理特性、免疫状态动态变化特征评价以及分子调控机理方面尚缺乏基础数据和理论支撑。众所周知，母牛繁殖效率低下与围产期疾病密切相关，因此基于围产期繁殖生理特征评价科尔沁黄牛的免疫状态（免疫抑制程度），探讨相关分子机理，对于了解其品种特性具有重要价值。就围产牛而言，外周血免疫细胞如淋巴细胞、中性粒细胞的细胞群、增殖能力及存活周期的动态变化，是反映机体细胞免疫应答水平及其介导特异性免疫应答能力直接依据，而这些细胞动态变化的信号调控网络中，热休克蛋白70（HSP70）是一种重要的信号分子，在稳定和维持应激过程中的细胞功能上具有重要作用。.项目实施和完成的主要内容：（1）利用放射免疫法检测了外周血糖皮质激素（G）、雌二醇(E2)和孕酮(P)浓度，分别确定了其“范型”；（2）采用流式细胞术对淋巴细胞的G0/G1、G2/M、S期周期指数进行了分析，结果绝大多数细胞停止于G0/G1 期（高于99%），而G2/M、S期则极少，并且生产前后变化不显著；（3）利用实时荧光定量RT-PCR法分析了淋巴细胞HSP70mRNA表达，结果其表达与GC、E、P具有显著的浓度依赖性特点；（4）利用SDS-PAGE定量分析了淋巴细胞HSP70蛋白的表达状况，结果其表达与GC、E、P也具有浓度依赖性特征；（5）测定了血浆MDA浓度，初步确定其变化规律；（6）利用流式分析仪和动物血细胞分析仪进行细胞类型及数量分析的结果不理想，重复检测结果的差异过大，无法达到统计分析的要求。扩展研究内容：（1）淋巴细胞糖皮质激素受体（GR）mRNA的实时荧光定量分析；（2）PMNs的雌激素受体（ERα、β）mRNA的RT-PCR相对定量分析、bcl-2、p53和caspase-3基因mRNA的荧光定量RT-PCR分析。. 本项目是国内外首次开展的科尔沁牛围产期免疫生理的研究，有关成果将是未来深入了解科尔沁黄牛围产期生殖生理特征及其动态模式、评价围产期免疫抑制状态、揭示围产期免疫细胞的功能变化及其分子机制的可靠理论参考，同时也可为制定和实施科尔沁黄牛繁育、围产期饲养管理和疾病控制提供科学依据。