昆虫Toll受体激活途径的一种负向调控因子的一级结构及其作用

利用自有的富集纯化体系结合常规柱层析法，从柞蚕幼虫血淋巴中纯化获得一种作用靶点明确，即针对柞蚕Toll受体激活途径中Sp?tzle激活酶的负向调控因子-柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂（Ap-Serpin）。考察天然活性Ap-Serpin与重组的柞蚕Sp?tzle 激活酶的作用特点及其对柞蚕Toll信号转导途径的作用；利用Ap-Serpin的N-末端和分子内部分氨基酸序列，分别从cDNA文库、cDNA pool和染色体DNA中获得该蛋白的cDNA和染色体DNA序列，比对验证序列，获得该蛋白的一级结构信息。对这种首次发现的、作用靶点明确的Toll受体激活途径的负向调控因子的一级结构解析和其与Toll信号转导途径相关性的研究，可完善现有的昆虫Toll信号转导途径分子机制及其调控理论，加深对天然免疫系统内各种免疫机制的稳定和负向调控的理解，也可为制定有效的柞蚕病虫害防治策略提供理论依据。

先天性免疫系统是当外源微生物入侵时宿主产生的一种防御手段，其中Toll受体激活途径是昆虫体内重要的先天性免疫机制之一。它反应快速、灵敏，当病原体入侵数秒后即可启动，产生大量具有活性的抗菌肽，进而将病原体杀死。然而，过度产生免疫应答会对宿主造成自身伤害，所以对激活免疫应答的上游信号进行精确调节至关重要。Serpin（serine protease inhibitor）是蛋白酶抑制因子中最大也是最重要的超家族，Serpin使用自杀底物原理与靶酶形成稳定的共价复合物，导致靶酶失活。近年来，对于Serpin如何调节昆虫的先天免疫应答已经成为了该领域研究的热点。.本研究首次利用自有的富集纯化体系结合常规柱层析法，从柞蚕幼虫血淋巴中纯化获得两种作用靶点明确的丝氨酸蛋白酶抑制剂（Ap-Serpin 1和Ap-Serpin 3），通过共价结合丝氨酸蛋白酶级联放大系统中的特定丝氨酸蛋白酶进而特异性抑制由不同种类病原体诱导的先天性免疫反应。本研究还首次通过分子生物学技术，获得柞蚕Ap-Serpin 1和Ap-Serpin 3基因序列并对其进行一级结构解析。利用体外重组的Ap-Serpins在体外实验研究其生物功能时发现：重组Ap-Serpin 1通过与柞蚕丝氨酸蛋白酶HP8形成稳定的共价复合物，特异性作用于真菌所诱导的Toll受体激活途径和酚氧化酶原激活系统；而重组Ap-Serpin 3不仅可抑制Toll受体激活途径中Spätzle激活酶（SAE），还可与酚氧化酶原激活系统中酚氧化酶原激活酶（PPAE）共价结合，从而有效地抑制由β-1,3-葡聚糖、脂多糖、脂磷壁酸介导的柞蚕先天性免疫反应。结合柞蚕、黄粉虫及烟草天蛾等昆虫Serpins的研究结果，概括出模式昆虫Serpin的结构、功能以及参与丝氨酸蛋白酶级联的活性调控机制。同时，本研究还首次通过天然纯化和体外重组手段获得柞蚕酚氧化酶原（Ap-PPO）及其cDNA全序列，并对其结构和功能进行了初步研究。.综上所述，对柞蚕两种Serpin及酚氧化酶原的研究，不仅完善了现有的昆虫Toll信号转导途径分子机制及其调控理论，加深对先天性免疫系统内各种免疫机制的稳定和负向调控的理解，同时也为制定有效的柞蚕病虫害防治策略提供理论依据。