骨质疏松患者中SEMA3B调控miR-214介导的信号通路影响骨髓间充质干细胞成骨分化及其机制研究

The expression profile and regulation mechanism of lncRNAs/miRNAs in the senile osteoporosis bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) remains unclear. Our previous results confirmed that compared with the BMMSCs in normal subjects, the expression of lncRNA SEMA3B was decreased in the senile patients with osteoporosis, while was increased in the process of osteogenic differentiation. SEMA3B can potentially target miR-214 and inhibit its expression. Four bone differentiation related genes, including ATF4, FGFR1, PTEN, Osterix, were predicted targets of miR-214. We speculated that SEMA3B may affect the expression of downstream target genes by directly targeting miR-214 , therefore, regulating the osteogenic differentiation of BMMSCs. .Using pull-down, dual luciferase reporter system, we aimed to explore the effects of SEMA3B/miR-214 and its target genes on osteogenic differentiation of BMMSCs and its regulation mechanism. The therapeutic effect and mechanism of SEMA3B in the rapid aging model mice SAMP6 will be further conducted. These studies may finally clarify the molecular regulatory pathway of SEMA3B/miR-214/target genes in the development of osteoporosis and provide a new theoretical basis and therapeutic targets for better treatment of osteoporosis disease.

老年骨质疏松患者骨髓间充质干细胞中lncRNA/miRNA表达变化和调控机制尚不清楚。我们的前期研究结果证实，与正常人骨髓间充质干细胞（BMMSCs）相比，lncRNA SEMA3B在骨质疏松患者中表达降低，但在成骨分化过程中逐渐增加。SEMA3B可以潜在靶定miR-214并抑制其表达，miR-214下游具有多个骨分化相关靶基因ATF4、 FGFR1、 PTEN、Osterix。我们推测SEMA3B通过直接调控miR-214影响靶基因表达，从而调控干细胞成骨分化。.本课题拟应用pull-down、双荧光素酶报告系统等手段探索BMMSCs中SEMA3B/miR-214及靶基因对成骨分化的影响及调控机制，研究SEMA3B在快速老化模型小鼠中的治疗效果及机制，最终阐明SEMA3B/miR-214/靶基因介导的分子通路在骨质疏松发生发展中的机制，为更好的治疗骨质疏松疾病提供新的理论依据和治疗靶点。

骨质疏松（OP）是以骨密度降低、骨微结构破坏和脆性骨折发生风险增加为主要特征的全身代谢性骨骼疾病，可致残致畸。而目前，OP发病率高却又无明确有效的治疗途径，严重影响了我国人民的生活质量和健康寿命，已经成了我国亟待关注的重大公共健康问题之一。长链非编码RNA（lncRNAs）已被证明在各种生物过程中扮演重要角色，通过调控DNA、RNA、蛋白等分子发挥作用，其表达紊乱与多种人类疾病的发生发展密切相关。我们的前期研究结果证实：在正常人和OP患者中，骨髓间充质干细胞（BMSCs）lncRNA SEMA3B-AS1表达存在差异。因此，我们推测SEMA3B可能通过调控靶基因表达，影响干细胞成骨分化，从而调控OP的发生发展。因此，我们通过MTT实验、茜素红染色确认SEMA3B-AS1对BMSCs成骨分化的作用。通过构建FISH特异性探针，利用FISH定位检测实验确认SEMA3B-AS1在核质分布情况；通过RNA pull down实验结合质谱找到SEMA3B-AS1潜在的互作蛋白，从RNA pull down结果中筛选出互作蛋白HNRNPU后，采用IP级别抗体，用HNRNPU蛋白反向拉取互作RNA，同通过qPCR检测SEMA3B-AS1的富集情况，反向验证SEMA3B-AS1与HNRNPU互作结合。通过构建过表达及干扰HNRNPU质粒，分别转染BMSCs，以CCK8检测BMSCs细胞增殖能力的差异；qPCR和WB检测成骨分化相关基因及观察在细胞中的生长变化。最终，我们发现：SEMA3B-AS1对BMSCs成骨分化发挥抑制作用；RNA pull down、RIP实验和qPCR实验反复证实了SEMA3B-AS1 与HNRNPU之间存在相互作用；而HNRNPU能促进BMSCs成骨分化。因此，SEMA3B-AS1可能是通过与HNRNPU相互作用，从而发挥抑制BMSCs成骨分化的作用。随后通过蛋白组学和转录组学进一步揭示了SEMA3B-AS1过表达后下游mRNA表达谱和蛋白表达谱的改变：SEMA3B-AS1过表达后，下游共鉴定到1442个差异基因和220个差异蛋白，这些差异基因均挑选部分qPCR进行了验证。此项目为骨质疏松疾病提供新的理论依据，并为其治疗提供了新的治疗靶点，而鉴定出的差异基因和蛋白为后期进行骨质疏松的相关基础研究提供了新的思路。