二至丸对绝经后骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的调控机制研究

The major pathological change of postmenopausal osteoporosis（PMOP） is loss of bone mass. Previous studies found that the imbalances between osteogenesis and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are closely associated with PMOP, these findings led to the discovery that the classic Wnt signaling pathway is the major regulation pathway for the osteogenesis and adipogenic differentiation of BMSCs. It is speculated that the mechanism of Er Zhi WanWan is working by activating the pathway to facilitate osteogenesis differentiation of BMSCs, and inhibiting adipogenic differentiation. From the prospects of mobilization、proliferation、migration and proliferation of BMSCs, the current project is to explore the pathways and targets of Er Zhi Wan prescription for preventing PMOP by studying the major regulation pathway of BMSCs differentiation. This project will offer scientific connotation for " Nourishing yin and tonifying kidney " and theoretical and experimental basis for PMOP clinical treatment.

骨量的丢失是绝经后骨质疏松(PMOP)的主要病理改变,以滋阴补肾为治则的中药二至丸在临床上治疗绝经后骨质疏松（PMOP）疗效确切，我们的前期工作也表明，二至丸能显著增加肾阴虚骨质疏松模型大鼠骨密度、骨矿含量和骨影面积，增加血清雌二醇水平，从而改善PMOP，但作用机制尚不明确。既往研究发现骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化和成脂分化的失衡与PMOP密切相关。进而发现经典Wnt信号通路是BMSCs成骨与成脂分化的主要调控途径，因此我们推测二至丸治疗PMOP的机制正是通过激活该通路来促使BMSCs成骨分化,并抑制其成脂分化。从 BMSCs的动员、增殖、迁移和分化多个层面,并通过研究BMSCs分化的主要调节通路，探讨二至丸防治PMOP的作用途径和靶点。本研究将为“滋阴补肾”的科学内涵以及PMOP的临床辨证治疗提供理论和实验基础，因此具有非常重要的实际意义和临床研究价值。

本课题运用两种造模方法：经典的双侧卵巢摘除法和维甲酸80mg/kg/d连续灌胃21天造模的方法成功制备了PMOP模型。通过骨密度检测、电镜光镜观察、骨组织形态计量学测定、生化指标检测等方法，观察二至丸对两种PMOP模型大鼠的防治作用。结果显示二至丸对两种PMOP大鼠模型均有防治作用，其中以高剂量组防治作用最强。运用流式细胞术、CKK8检测对PMOP大鼠BMSCs动员、增殖、分化的影响，结果显示二至丸能够影响PMOP大鼠BMSCs的增殖周期，促进BMSCs的增殖，同时能够减少BMSCs的凋亡。并且通过光镜观察二至丸还能够促进BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化。此外，通过Western blot 和real-time PCR的方法，检测了调控BMSCs分化的经典Wnt通路中的关键蛋白和基因Wnt3a、LRP5、β-catenin、DKK1、Runx2、PPARγ和C/EBPα等，探讨二至丸对PMOP大鼠的BMSCs成骨和成脂分化的机制。结果显示造模后，BMSCs调控途径Wnt通路被抑制，二至丸具有激活该通路的作用。运用台盼蓝染色、流式细胞术、CKK8检测、TUNEL染色、MTS法及Transwell法，观察二至丸水提物对体外培养的大鼠BMSCs活性及凋亡、增值能力、细胞迁移的影响，运用油红O染色、茜素红染色、real-time PCR的方法检测二至丸对骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化的影响，以及对主要调节通路Wnt信号通路关键蛋白和基因表达的影响，结果显示二至丸能够提高BSMCs活性减少凋亡，促进BMSCs的增殖、迁移和成骨分化。并且，对主要调控通路，经典WNT信号有明显的促成骨分化和抑制成脂分化的作用。此外，还运用了siRNA基因干扰技术，确认二至丸对BMSCs分化通路调节的特应性靶点，结果显示，二至丸对wnt3a干扰后的BMSCs有激活作用，从而确定Wnt3a是二至丸调控BMSCs分化的经典通路中的主要作用靶点。二至丸由女贞子、墨旱莲2味药组成，有益肝肾、补阴血、壮筋骨的疗效，本研究将二至丸用于干预骨质疏松模型大鼠，结果显示随着剂量的增加，二至丸在增加模型鼠骨密度等方面疗效越显著，且随着浓度的增加，大鼠Wnt3a、β-catenin、LＲP5 表达越明显，PPAＲγ 表达越下调。阐明骨质疏松大鼠“滋阴补肾”的科学内涵，为中医骨伤科的临床辩证治疗提供新的思路。