水稻谷蛋白合成途径关键基因OsRab5a的功能研究

水稻谷蛋白是仅次于淀粉的胚乳组分并易为人体所吸收，其含量和组成直接影响稻米的各项品质指标，已成为水稻品质改良的重要对象之一。谷蛋白的合成、转运和沉积是一个复杂的细胞学过程，而谷蛋白前体增加突变体（57H）是研究该过程的优良材料。前期研究中我们筛选到一个全新的57H突变体Q4041，并已经分离出突变基因为OsRab5a，但该基因如何调控谷蛋白的运输、淀粉的合成等尚不清楚。拟通过电镜和免疫金标记研究突变体和野生型发育胚乳中ER、Golgi体、蛋白体等的形态差异及谷蛋白的亚细胞分布；采用Microarray和2-D电泳鉴定基因突变所影响的网络途径；结合转基因后代的鉴定、免疫杂交、蔗糖密度梯度离心、同位素标记以及OsRab5a的体外表达、互作蛋白的筛选等全面研究基因功能，阐明OsRab5a在水稻种子胚乳发育中的作用，提高人们对水稻谷蛋白转运途径的认知，为稻米的品质改良提供理论依据。

蛋白质是水稻种子中仅次于淀粉的第二大物质，其含量和组成将会影响稻米的外观、营养和食味品质。稻米中的蛋白以储藏蛋白为主，约占稻米干重的8-10%，其中谷蛋白是最重要的储藏蛋白。虽然谷蛋白结构基因大都被克隆，其表达调控业已深入研究，但是对稻米蛋白品质的改良仍然较为困难，一个重要的原因是谷蛋白在内质网表面合成后需要经过复杂的运输途径最终沉积在PBII中，而目前对该途径的研究相对较少。本项目中以一个谷蛋白前体增加突变体gpa1为研究对象，通过超薄切片技术观察了gpa1及其野生型N22发育胚乳的超微结构，发现突变体发育胚乳细胞中出现三种新型的膜结构，包括“囊泡状结构”、和“液泡状结构”；免疫胶体金研究表明谷蛋白被错误分选到“囊泡状结构”和“囊泡填充状结构”及胞外空间。采用图位克隆的策略发现gpa1的突变基因为一小G蛋白Rab家族基因OsRab5a，并确认OsRab5a确实具有GTP的结合活性。亚细胞定位表明OsRab5a定位于蛋白合成途径的高尔基体和前液泡区室（PVC）中。Microarray对发育胚乳的研究表明OsRab5a的突变影响了磷脂酰肌醇途径，暗示OsRab5a在细胞的信号传导中起着重要的作用。采用酵母双杂交技术，筛选获得了OsRab5a的两个互作蛋白，为进一步探讨OsRab5a的功能奠定基础。我们的研究发现了一个控制谷蛋白分选的关键基因OsRab5a，它在蛋白的后Golgi体运输中起着重要的作用，同时OsRab5a还控制胚乳细胞内膜系统的结构。