GPA1/OsRab5a互作蛋白RIP1调控水稻谷蛋白运输的分子机制研究

Protein is one of the major nutritional components in rice. The content and composition of protein significantly affects the rice quality. Previous study with the rice 57H mutant gpa1 showed that GPA1/OsRab5a is essential for the post-Golgi trafficking of the major storage protein — glutelin. In our later study, we identified one interacting protein of OsRab5a Q70L (a GTP-locked constitutive active form of OsRab5a) RIP1 (OsRab5a interacting protein 1) through yeast two hybrid assay. Further, we successfully obtained the knockout mutant of RIP1 by CRISPR/Cas9 technique. The rip1 mutant shows the 57H phenotype and floury endosperm, which resembles the phenotype of gpa1, indicating that RIP1 plays important roles in glutelin trafficking as well. In addition, RIP1 contains a pleckstrin homology (PH) domain, which is the 11th most abundant domain class in the human genome and shows diverse functions, such as cellular signaling, cytoskeleton organization, membrane trafficking and/or phospholipid modification. However, the detailed functions of PH domain containing proteins are largely unknown in mammalian cells and yeast, not to mention studies in plants. Therefore, dissection of the molecular function of RIP1 in rice will contribute to the understanding of PH-domain containing proteins. Moreover, increaseing our knowledge on the rice glutelin trafficking pathway, which lays the foundation for protein quality improvement in rice.

蛋白质是稻米中主要的营养物质之一，其含量和组成对稻米的品质有着重要的影响。前期研究中我们通过对水稻谷蛋白前体增加突变体gpa1的鉴定发现GPA1/OsRab5a对稻米中最主要的储藏蛋白--谷蛋白的后高尔基体运输是必须的。后续研究中我们通过酵母双杂交实验筛选获得了Rab5a Q70L互作蛋白RIP1，并采用CRIPSR/Cas9技术对RIP1进行了敲除，获得了RIP1的缺失突变体，该突变体表现为谷蛋白前体大量增加，同时胚乳粉质，表型与GPA1十分相似，说明RIP1在谷蛋白的转运中起着重要的作用。另一方面RIP1是一个包含PH结构域的蛋白，该类蛋白功能较为多样，动物和酵母中对其功能解析尚不深入，植物中的研究报道更少，因此，RIP1的功能解析将有助于人们该对该类蛋白功能的认识，同时进一步提高我们对水稻谷蛋白转运途径的理解，为稻米蛋白品质改良奠定基础。

前期研究我们报道了GPA1/OsRab5a调控谷蛋白的后高尔基体转运。OsRab5a为一个小G蛋白，小G蛋白需要招募效应子进行作用，为进一步解析GPA1/OsRab5a调控谷蛋白转运的分子机制，我们通过酵母双杂交实验，以OsRab5a (Q70L)为诱饵，对水稻发育胚乳的酵母文库进行了筛选，获得一个互作蛋白，我们将其命名为Rab5a Interacting Protein2。RIP2编码一个包含脂质结合的PH结构域蛋白OsSWAP70A，且该蛋白特异与OsRab5a活性态互作，而与失活态OsRab5a不互作，暗示OsSWAP70A可能是OsRab5a的效应子蛋白。我们利用CRISPR/Cas9技术对OsSWAP70A进行了敲除，获得了OsSWAP70A的纯合突变体（命名外KO-SWAP70A）。本项目在此基础上拟对OsSWAP70A进行系统的功能研究以期揭示其作用的分子机制。通过Y2H和Pull down等试验，我们意外发现OsSWAP70A更可能是植物特有类型的Rab5（OsRab5b）的效应子，而植物特有类型的Rab5的功能在植物中并不十分清楚，因此我们的研究将可能揭示植物特有类型Rab5的分子功能。亚细胞定位表明OsSWAP70A和OsRab5b均具有明显的细胞膜定位（而传统类型的Rab5，如OsRab5a在TGN和PVC定位）。GPA2/VPS9a是水稻中4个Rab5的鸟核苷酸激活因子，我们的研究发现gpa2突变体和KO-SWAP70A对盐和稻瘟病菌均比野生型敏感，暗示他们可能参与到植物的逆境响应。我们对KO-SWAP70A进行了RNA-seq分析，并通过后续的qRT-PCR进行了验证，发现大量的抗性相关基因如WRKY类转录因子、Xa21等显著下调。我们的研究将可能进一步解析传统类型Rab5的功能，并揭示VPS9a-Rab5b-SWAP70A-Rac1在植物逆境响应中作用分子机制。