人类高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)动物移植瘤模型的建立与分析研究

人类高级浆液性卵巢癌(HGSOC)占上皮卵巢癌（EOC）的70%,但因其发病机制不清和缺乏有效诊治措施，致死率很高。本项目的前期研究和分析表明，HGSOC可能源于卵巢表面上皮细胞（OSE）或输卵管上皮细胞(FTE)；与致癌基因hTERT、AKT2、c-myc、CDK4、cyclin D1、IL-8、Gro-1等的突变/激活，抑癌基因p53、pRb、BRCA1、BRCA2等的突变或失活，及肿瘤微环境间质细胞的调配密切相关。本研究拟用不同组合导入或沉默上述致癌/抑癌基因，使正常OSE或FTE永生化和转化，在非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠（NOD/SCID）体内建立具有人类HGSOC病理学特征的肿瘤移植模型，或与人类间质成纤维细胞一起建立间质-上皮相互作用模型。通过分析HGSOC发生的基因表达图谱，初步揭示HGSOC发生机制。该动物模型的建立对有效诊治人类HGSOC可能具有重要的应用价值。

上皮卵巢癌占卵巢癌总数的85%以上，由于发病症状隐匿，绝大多数病人确诊时已属晚期而导致高死亡率，因此早期诊断是防治卵巢癌的主要策略之一，而对上皮卵巢癌发生机制的深入和系统了解是制定早期诊断策略的主要途径。由于上皮卵巢癌目前没有成熟的动物模型，我们的科研计划书拟以人类正常卵巢/输卵管上皮细胞为基础，通过敲低抑癌基因表达、导入致癌基因/突变基因/端粒酶基因等方法，在体外构建永生化细胞和转化前细胞，最后在动物体内接种成功，构建具有与人类上皮卵巢癌病理组织学相同的卵巢癌模型。在此基础上，通过基因表达谱、转录组测序、microRNA测序等方法对系统建立的细胞系进行比较分析，筛选功能基因并将其用临床标本验证，确定其早期诊断的意义。同时该动物模型还可以用于卵巢癌化疗药物敏感性、抗性的研究和分析。本课题通过导入p53和pRb shRNA结合hTERT cDNA的方法，成功建立了p53和pRb基因同时沉默并过表达hTERT的永生化细胞系；课题组同时分别构建了3株表达cdkR24C+cyclin D1+hTERT的永生化卵巢和输卵管上皮细胞系；在5株永生化卵巢和输卵管上皮细胞中，导入了致癌基因如c-myc (T58A)，AKT2，或沉默了BRCA1或BRCA2，并完成了永生化细胞中相关蛋白如p53、pRb、BRCA1、AKT2、hTERT、c-myc等的表达检测。.在此基础上，我们进行了软琼脂克隆独立生长检测，发现8个细胞系可以形成独立生长的克隆，对其中7个细胞系分别进行了动物（NOD/SCID）皮下和腹腔接种，但未观察到动物荷瘤现象；我又从上述部分细胞系选了4株细胞系导入了IL-8或Gro-1基因，并进行动物接种试验，也未观察到成功荷瘤；最后我们用OScch//p53DNM//BRCA1siRNA//c-myc(T58A)和 FT5rh//BRCA1siRNA//BRCA2siRNA//AKT2)细胞系与来自卵巢癌的癌相关成纤维细胞（CAF）共同培养后，进行了动物成瘤试验和观察，目前尚未得到动物荷瘤的形成。目前动物实验中成瘤的模型尚未得到，可能需要调整基因导入的顺序或寻找其他卵巢癌中异常激活的致癌基因如Notch3和失活的抑癌基因如pTEN等。我们正在构建这些细胞系模型。