拟南芥嵌合型伸展蛋白PEXs在花粉萌发和花粉管生长中的功能和分子机制

In sexual reproduction of angiosperms, pollen germination and pollen tube elongation is one of the essential processes ensuring successful double fertilization. Base on our preliminary work on proteomic analyses of proteins in germinating Arabidopsis thaliana pollens, four high-pollen and pollen tube-expressed proteins, chimeric extensin pollen extensin-like 1-4 (PEX1-4), are as the main research object to explore their functions in plant sexual reproduction. The triple and quadruple pexs mutants display a significant reduction in male transmission efficiency. The pollen germination and the morphology of pollen tube are abnormal and ruptured in vitro, and grow slowly in vitro in the triple and quadruple pexs mutants. In this proposal, we plan to utilize the phenotypic observation and function complementary providing genetic evident for PEXs’ functions, and perform the assay of expression pattern and subcellular localization, coupled with cell wall composition analysis and immnolabeling for detection the cell wall sugars changes, and conduct yeast two hybrid screen and immune co-precipitation to find the interacting proteins for LRR domain of PEXs, and detect the cytoplasmic changes infected by disturbed cell wall, to further understand the function and molecular mechanisms of PEXs on pollen germination and pollen tube elongation.

被子植物中花粉萌发和花粉管伸长是成功双受精的必要条件之一。基于拟南芥花粉萌发前后的差异蛋白质组学研究，本项目以4个在花粉和花粉管中特异表达的嵌合型伸展蛋白 Pollen extensin-like1-4 (PEX1-4) 为研究对象，探究其在花粉萌发和花粉管伸长的重要功能。初步的研究结果表明，pexs突变体雄配子体的传递效率显著下降；体外花粉萌发率下降，花粉管形态异常、破裂，体内花粉管生长缓慢。本项目通过对pexs突变体的表型分析和遗传互补，明确PEXs的生物学功能；通过表达谱和亚细胞定位分析，研究PEXs基因及其蛋白的表达和定位；通过多糖免疫组化和细胞壁单糖定量分析，检测花粉管中细胞壁多糖组分的分布和含量，通过酵母双杂交和免疫共沉淀技术寻找PEXsLRR结构域的互作蛋白；并检测细胞壁变化对花粉管细胞内部的影响，以探究花粉管细胞壁蛋白PEXs的功能和作用机制。

被子植物的有性生殖是保证物种延续的重要生理过程，其中花粉萌发和花粉管的伸长是成功有性生殖的关键步骤之一。花粉管的完整性是精细胞运送至卵细胞的重要保障，对其分子机制的探究成为研究的热点科学问题。花粉管的完整性有赖于受体激酶和胞外多肽介导的信号传导，活性氧，金属离子，细胞壁等。花粉的细胞壁在细胞膨压下维持细胞的完整性中发挥重要的作用，但花粉管的细胞壁蛋白维持花粉管完整性的研究几乎是空白。.本项目对四个花粉细胞壁定位的leucine-rich repeats extensins（LRXs）蛋白LRX8, 9, 10和11在花粉萌发和花粉管生长过程中的功能进行了深入研究。研究表明：（1）lrx8、lrx9、lrx10、lrx11 单突变体，双突变体、三重和四重突变体，营养生长正常，但三重和四重突变体的结实率显著下降。所有突变体成熟花粉的形态和活性正常，但雄配子体的传递效率显著下降。体外花粉萌发中三重和四重突变体表现出不同程度的花粉破裂和花粉管畸形表型，体内花粉管生长显著缓慢，LRX8-11 四个成员协同地维持花粉管的完整性。（2）气相色谱-质谱结果显示lrx9,10,11突变体花粉管细胞壁中鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，木糖，半乳醛酸糖和晶体化纤维素含量显著下降，甘露糖含量升高。免疫组化实验显示lrx9,10,11和lrx8,9,11花粉管细胞壁鼠李糖半乳聚糖 I 和胼胝质显著升高，而岩藻糖化的木葡聚糖含量显著降低；而花粉管中ROS含量无显著变化。RNA-seq实验表明lrx8,9,10突变体花粉管中仅有21个基因的表达下调，暗示LRX8-11可能位于花粉管生长信号通路的下游。（3）LRX8有部分的N-糖基化修饰，其LRR结构域可以部分恢复突变体的表型，而仅包含extension结构域的LRX8蛋白则不能恢复。通过对LRX8的酵母双杂交和免疫共沉淀实验分别获得13个和203个可能互作的蛋白，进一步通过荧光素酶互补实验表明LRX8与RALF4/19以及功能未知蛋白PHP5相互作用，在维持花粉管的完整性中发挥重要作用。.该研究揭示了花粉特异表达细胞壁蛋白LRXs的重要功能，解析了维持花粉管完整性的新机制，更为将来农业生长实践中培育雄性不育系，培育高产优质的新品种提供重要的理论依据。