单克隆抗体药物的质谱分析方法发展及其应用研究

Monoclonal antibodies (mAb), as one of the most important protein drugs have attracted more and more attention. However, the traditional ELISA method for the pharmacokinetic study of proteins is limited with long term development, high cost and cross talk between different proteins. Therefore, new approach is highly desired to meet the requirement of the analysis of therapeutic proteins like monoclonal antibodies in complex biological samples. Herein, a platform based on mass spectrometry will be developed for the pharmacokinetic study of monoclonal antibodies. Compared with conventional approach, it will enable the quantitative and qualitative (protein modification) analysis at the same time. Simutaneously multiple peptides can be used for the quantification of the protein, which will eliminate the potential error between experiments. We also design the tryptic site with the isotope internal peptide to improve the reproducibility with digestion. This project will greatly accelerate the pharmacokinetic study of protein drugs with the aim of establishing a platform of high sensitivity, high accuracy and high specificity based on mass spectrometry technologies.

单克隆抗体药物(mAb)是以免疫球蛋白结构为基础的一类大分子蛋白类药物。由于单抗类药物受生物体内特异性抗原和受体的影响较大，目前对于单抗药物的作用机制和体内代谢过程研究很不充分，因此建立规范可靠的分析方法对单克隆抗体药物研发具有重要意义。针对现有免疫方法开发周期长、成本高、蛋白交叉反应的不足，我们拟发展以质谱技术为核心的单抗类药物分析新方法。本方法的特色和创新之处：（1）可实现对单抗类药物在体内不同修饰形态的识别和定量分析；（2）采用多个肽段对抗体蛋白进行定量，可避免由于蛋白交叉反应引起的实验误差；（3）设计具有酶切位点的稳定同位素标记肽段为内标，可大大提高分析结果的准确性和重现性。 通过本项目的实施，将建立灵敏度高、准确性好、专属性强的单抗药物分析方法，促进对单抗类药物体内代谢过程的研究，加深对单抗类药物作用机制的认识和了解，为单抗等蛋白类药物的研发与评价奠定理论和方法学基础。

治疗性单克隆抗体药物（Therapeutic monoclonal antibody, mAb；以下简称单抗药物）是一类以γ型免疫球蛋白G（Immunoglobulin G, IgG）为结构基础的大分子蛋白类药物。目前，已有超过50种单抗药物由FDA和欧盟医药产品管理机构（EMA）批准上市，还有40余种单抗药物处于临床Ⅲ期研究阶段。单抗药物的迅速发展及其在多种疾病治疗中日益凸显的重要性都对单抗药物研发及用药安全提出了更高的要求。因此，建立规范可靠的分析方法并开展单抗药物的药代动力学及药效动力学研究具有十分重要的意义。.基于蛋白质组学的研究方法，对贝伐珠（Bevacizumab）单克隆抗体药物进行了肽谱和糖基化修饰形态的定性分析，建立测定贝伐珠单抗及其糖基化修饰的质谱定量分析方法，考察单抗药物本身及其糖基化修饰在体内的药代动力学特征，为药物研发和临床安全用药的研究提供新的途径及理论依据。.建立了对贝伐珠单抗及其糖基化修饰的质谱定性分析方法。结果表明贝伐珠单抗糖基化修饰中的糖链分子量主要集中在2~4 kDa。贝伐珠单抗的N-糖基化修饰位点位于重链的第303为天冬酰胺残基上，表征到H3N3、H4N4、H3N4、H4N3F1、H4N4F1、H3N3F1、H3N4F1、H3N5F1、H5N2、H6N2、H5N4F1、H8N2、H5N5、H4N3F1S1、H5N3F1、H6N3F1和H4N5共17种糖型。.确定了贝伐珠单抗的特征肽段，并合成了稳定同位素标记的肽段做内标，建立了对复杂基质中的贝伐珠单抗的PRM定量方法。采用内标法建立了贝伐珠单抗大鼠血浆标准曲线，线性范围为0.005-1.2 µg/µL，标准曲线为y=0.0684449x-0.000239987（r2=0.9980）。对高低剂量给药的大鼠血浆样品进行了检测，获得的药物浓度-时间曲线趋势一致。本研究同时对贝伐珠单抗的糖基化修饰的17种糖肽进行了定量分析。结果表明，不同的糖型在体内的代谢情况也不完全一致。同时提供了一种亲水富集糖肽的方法，为低丰度糖肽的分析提供了更具优势的方法。建立了对单抗隆抗体药物及其糖基化修饰的定性、定量分析方法，为药物代谢动力学研究提供了新思路、新方法。