基于生物质谱技术的酪氨酸磷酸酶底物的蛋白质组学筛选

Protein phosphorylation is involved in numerous important aspects of human cellular physiology in health and disease and is controlled by coordinate actions of protein kinases and phosphatases. Protein tyrosine phosphorylation usually acts in the upstream of serine/threonine phosphorylation. Protein tyrosine phosphatases, as the factor of negative regulation of phosphorylation, play an important role in cellular signaling pathways. Therefore, the interpretation of substrates of tyrosine phosphatases is of critical importance. Traditional approaches for protein substrate screening have the limitation of indirect, insensitive and lack of site information. Mass spectrometry-based proteomic method provides the possibility for the high throughput screening of protein tyrosine phosphatase substrates. This project will utilize the tyrosine phosphorylated proteins in cell lysate as natural library for screening. The tyrosine phosphopeptides will be enriched from the digest of extracted proteins and then undergo phosphatase reaction. High resolution mass spectrometry will be used for the qualitative and quantitative analysis of dephosphorylated peptides. Phosphatase inhibitor stimulation will be carried out on cellar level for global quantitative phosphoproteomic analysis to monitor the phosphorylation change. The integration of the above data will achieve the high throughput screening of protein tyrosine phosphatase substrates and the identification of phosphorylation sites simultaneously. The construction of network of tyrosine phosphatases and their substrates will provide important information for the discovery of novel biological functions.

蛋白质磷酸化受着激酶和磷酸酶的双重调控，磷酸化调节的失衡与众多疾病的发生发展有着重要的关系。酪氨酸磷酸化一般发生在丝氨酸和苏氨酸磷酸化的上游，在信号传导过程中发挥着重要的作用。蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）作为负调控因子，对底物的去磷酸化作用影响着磷酸化级联事件的发生和细胞信号的传递，因此阐明PTP对底物的调控机制显得尤为重要。传统的底物筛选方法有着级联效应干扰、灵敏度低、位点信息缺失等不足，基于生物质谱技术的蛋白质组学手段为PTP底物的筛选提供了可能。本项目拟发展基于高分辨质谱技术的磷酸酶底物的高通量筛选新方法，以细胞中酪氨酸磷酸化蛋白质为对象，用重组PTP对酶解后的磷酸化肽段进行体外反应，同时结合PTP抑制剂作用下的磷酸化动态变化进行体内验证，从而实现PTP底物的规模化鉴定。本项目的实施可实现对PTP底物及其磷酸化位点的规模化鉴定，为PTP生物学功能研究提供重要的理论依据和数据支撑。

本研究发展了蛋白质酪氨酸磷酸酶的底物高通量筛选的蛋白质组学新方法，可以大规模的筛选酪氨酸磷酸酶的底物并鉴定其作用位点，为酪氨酸磷酸酶在细胞信号传导过程发挥的重要调节作用提供重要的参考价值。将其应用于若干种PTPs对JAKs家族串联自磷酸化位点的去磷酸化过程以及不同的PTP对自磷酸化位点的优先选择性的研究，为揭示不同的PTP对JAK激酶家族串联自磷酸化位点的负调控机制奠定了理论基础。在体外考察了PTPs对磷酸化ITIM/ITSM的去磷酸化过程。揭示了PTPs的底物特异性，丰富了研究PTPs酶活性和生物学功能的手段。在细胞水平对其底物进行蛋白质组学的筛选。建立体外复杂酪氨酸磷酸化肽段底物库，进行酪氨酸磷酸酶底物的特异性研究。合成了几种带有磷酸化修饰的肽段，通过MALDI-TOF MS在体外考察了PTPs对磷酸化肽段的去磷酸化的特异性。初步筛选到了PTP-1B的特异性底物。利用免疫共沉淀的方法，从细胞水平捕获SHP2相互作用的蛋白，并进行蛋白质组学分析，初步筛选出SHP2的互作蛋白，用以后续的底物筛选研究与相互验证。开发了反相微乳液法的酪氨酸磷酸化分子印迹新材料，可高特异性识别蛋白质磷酸化与酪氨酸磷酸化位点，为蛋白质磷酸化亚型的分析提供了新的手段。