内皮细胞HSPA12B保护心肌缺血/再灌注损伤的机制研究：对"Exosome/miR-27a/Rubicon/自噬体成熟"信号的正调节

Impaired autophagic clearance resulted from disrupted autophagic maturation is a critical mechanism for the development of cardiac ischemia/reperfusion (I/R) injury. miR-27a/Rubicon signaling is important for autophagic maturation. HSPA12B is expressed specificly in endothial cells. During the former NSFC experiments, we observed that overexpression of HSPA12B in endothelial cells not only improved cardiac dysfunction,but also reversed the myocardial Rubicon induction and increased miR-27a content in endothelial cells - derived exosomes in cardiac I/R mice.These observations indicate that the cardioprotection of endothelial HSPA12B may mediated by miR-27a, which is transported from endothelial cells to cardiomyocytes by exosomes. To evaluate this posibility, we will eaxmined cardiac injury in HSPA12B transgenic mice and knockout mice following I/R. We will also determined whether the "exosome/miR-27a/Rubicon/autophgic maturation" signaling mediate the cardioprotection of HSPA12B using cell culture models. The results will provide novel clues for discovering potential intervention targets for the manegement and treatment of cardiac I/R injury.

自噬体不能成熟而导致的自噬过程中断，是心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的重要机制，而miR-27a/Rubicon信号对自噬体成熟至关重要。 HSPA12B是特异性表达于血管内皮细胞的基因。我们在前一项国家自然基金研究中发现：内皮细胞高表达HSPA12B不仅改善I/R鼠心功能，且降低心肌Rubicon表达、升高内皮细胞exosome中miR-27a含量，提示HSPA12B可能通过exosome负载的miR-27a激活心肌细胞Rubicon/自噬体成熟信号，从而减轻心肌I/R损伤。 本项目将在前期工作基础上，采用HSPA12B转基因鼠、敲除鼠，综合评价内皮细胞HSPA12B对心肌I/R损伤的保护作用，并结合细胞模型，阐明 "exosome/miR-27a/Rubicon/自噬体成熟"信号系统在其中的作用，以明确保护机制。研究结果将从细胞间信号传递的角度，为心肌I/R损伤的临床防治提供新思路。

随着生活水平提高和饮食结构的变化，冠状动脉粥样硬化带来的心肌缺血性疾病的发病率日益升高。不断进步的医学研究给缓解或纠正心肌缺血提供了各种行之有效的药物和手术干预措施，但同时也带了一个不容忽视的重大难题：因血流再灌注带来的急性心肌缺血/再灌注(I/R)损伤，包括心律失常、梗死面积扩大甚至心力衰竭。心肌I/R损伤的机制错综复杂，但大量研究显示内皮细胞功能受损在其中具有重要的病理生理作用。在前期研究中，我们发现HSPA12B，一种内皮细胞特异性表达的热休克蛋白，对心肌永久缺血具有显著保护作用。本研究中，我们对HSPA12B在心肌I/R损伤在中的作用进行探索。我们首先发现心肌I/R升高心肌组织中HSPA12B表达。采用HSPA12B转基因鼠制备心肌I/R模型，二维超声心动图显示HSPA12B高表达显著改善心肌I/R小鼠的心功能不全、缩小心肌梗死面积。心肌I/R引起的中性粒细胞向心肌间质浸润被HSPA12B过表达显著减少。TUNEL染色显示心肌I/R引起的心肌细胞凋亡被HSPA12B高表达显著抑制。EVANS蓝灌注结果表明，心肌I/R升高的心肌微血管通透性在转基因鼠中显著减轻。针对心肌微血管开放的特殊荧光染色表明，HSPA12B高表达显著缩小再灌注后的“无血流”面积。超微结构分析表明，心肌I/R引起的微血管内皮完整性损害和内皮细胞脱落现象在转基因鼠中被显著减轻，同时伴有紧密连接蛋白（如ZO-1等）表达增加。进一步研究发现，HSPA12B过表达激活I/R心肌中的PI3K/Akt//mTOR信号。当采用Wortmannin,一种广泛使用的PI3K抑制剂，注射HSPA12B转基因鼠后，消除或减弱了HSPA12B过表达对上述心肌I/R损伤的保护作用。这些结果表明，内皮细胞HSPA12B过表达通过维持血管内皮完整性和功能，继而保护心肌缺血再灌注损伤，提示干预血管内皮细胞HSPA12B可能是减轻心肌I/R损伤的潜在途径之一。