柴胡皂苷靶向DDX5逆转HER2阳性乳腺癌妥珠单抗耐药的作用机制研究

Trastuzumab resistance in HER2 postive breast cancer is a common problem in clinical practice. Dysregulation of some molecules in breast cancer cell is one of the most important mechanisms. The previous research had illustrated that the extract could reverse rastuzumab resistance in HER2 positive breast cancer. Base on the network pharmacology, it predicted that saikosaponins could reverse rastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting the DDX5. Our previous study also suggested that DDX5 was upregulated in trastuzumab-resistanct breast cancer cells and downregulation of DDX5 could re-sensitize breast cancer cells to trastuzumab. This project intends to clarify the molecular mechanisms of saikosaponins reversing rastuzumab resistance in HER2 positive breast cance by targeting DDX5. At the same time, we would discuss the active ingredients targeting DDX5 from Radix Bupleuri by using a variety of means. The research could provide theoretical and experimental basis for turning protein DDX5 and saikosaponins into new targets and drugs.

HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药是临床常见难题，HER2阳性乳腺癌细胞过表达的某些分子是发生耐药的重要机制。我们的前期研究揭示柴胡提取物可逆转曲妥珠单抗耐药，根据网络药理学研究方法预测柴胡皂苷类化学成分可能通过靶向DDX5逆转HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药。我们初步研究发现，DDX5在曲妥珠单抗耐药细胞中的表达明显高于亲本细胞，下调DDX5可抑逆转耐药。本项目拟阐明靶向DDX5柴胡皂苷逆转HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药作用的分子机制，同时运用多种手段活性靶向DDX5深入探讨中药柴胡中的活性物质，为把靶蛋白DDX5和柴胡皂苷转化为HER2阳性乳腺癌精准治疗的新靶点和新药物提供理论和实验依据。

柴胡为伞形科(Umbelliferae)、柴胡属(Bupleurum)多年生草本植物，在我国已有2000多年的药用历史。2020版《中国药典》规定柴胡为伞形科柴胡属植物北柴胡(Bupleurum chinense DC.)和南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根，本项目对北柴胡进行更加细化的活性追踪分离的同时也对南柴胡的化学成分进行了提取分离与结构解析。应用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、聚酰胺柱色谱、开放ODS柱色谱及PR-HPLC等手段，通过多种波谱光谱学等方法，鉴定了全部化学结构，共分离得到97个化合物，其中包括48个未见文献报道的新化合物。本项目通过运用网络药理学研究思路与生物信息学进行联合，成功构建了化合物-靶点网络、化合物-靶点-信号通路网络、蛋白质-蛋白质相互作用网络，并进行了GO和KEGG富集分析，对柴胡皂苷抗乳腺癌的靶蛋白、作用机制、活性成分群进行预测，为其能更好的深入研究提供理论支持，以上研究也是对网络药理学在中药作用机制研究方面的有益探索。通过分子对接技术进行柴胡皂苷与靶标蛋白Apoptosis regulator Bcl-2，C-X-C chemokine receptor type 4和Probable ATP-dependent RNA helicase DDX5相互作用模式研究，为后期用分子对接技术研究作用位点和构效关系奠定了基础。与此同时，应用柴胡皂苷处理HER2阳性乳腺癌细胞株收集富集mRNA，进行转录组学研究，实验结果进一步阐明了柴胡皂苷对乳腺癌治疗效果的作用机制。本项目对柴胡皂苷抗HER2阳性乳腺癌SKBR3细胞株和曲妥珠单抗耐药细胞株（SKBR3/R）进行了体内外药效学考察，包括CCK8细胞增殖检测，蛋白免疫印迹法检测蛋白表达变化，流式细胞术检测凋亡，裸鼠移植瘤实验等，为治疗 HER2 阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药提供前期研究基础，还为新靶点和新药研发提供新的研究思路。