利用基因组编辑技术建立长QT综合征干细胞模型

Congenital long QT syndrome (LQTS) is an autosomal hereditary cardiac disease characterized by a prolongation of the QT interval and a high risk of life-threatening arrhythmias. In fact, LQTS patient population without any treatment has a 50% mortality rate in 10 years. The sheer number of LQTS patients in our nation lies in the hundreds of thousands. At present, more than 1000 point-mutations associated within 13 genes have been associated with LQTS. β-blockers are the first-line therapy in LQTS1 patients, but their therapeutic effect is limited or unknown to other LQTSs. Therefore, further investigation is required for other LQTSs.Our previous studies have shown that the human pluripotent stem cell-based disease models are good tools to study LQTS. In this project, we will introduce patient specific mutations into human embryonic stem cells to generate LQTS1 models using genome editing technology. The relationship between mutations and cardiac risk or drug doses will be investigated. To further investigate different types of LQTS, we will also generate LQTS2-13 models and test the therapeutic effects of the 10 antiarrhythmic drugs. This study will not only provide evidential support for clinical drug application, but also set up a platform for LQTS disease modeling and drug testing. The methods and experience obtained in this study will make it possible to establish a LQTS bank for all the mutations and to tailor optimal drug cocktails and dosages to the various mutations.

遗传性长QT综合征(LQTS)是一种常染色体遗传性心脏病，不予治疗的患者10年死亡率可达50％。已有数据表明，我国的LQTS患者数量达几十万。前人研究发现位于13个基因上的1000多个突变位点可以导致该病。β受体阻滞剂是治疗LQTS的首选用药，对LQTS1的治疗效果较好，但对其他基因型LQTS的疗效有限或者不明。因此需要对不同基因型的LQTS进行深入研究，以发现针对性的治疗药物。申请人前期工作证实干细胞模型是研究LQTS的有效工具。本项目拟利用基因组编辑技术建立LQTS1的干细胞模型，研究突变位点与LQTS1发病风险及用药剂量的关系；同时制作其他12种基因型的LQTS干细胞模型，检测10种抗心律失常药物对这些模型的治疗效果，为临床用药提供参考。本项目方法、结果和经验有助于建立包括所有突变位点的LQTS疾病模型库，进而找到针对各个基因型或者突变位点特异的治疗药物和/或用药剂量。

遗传性长QT 综合征(LQTS)是一种常染色体遗传性心脏病，不予治疗的患者10年死亡率可达50％。已有数据表明，我国的LQTS 患者数量达几十万。根据突变基因的不同LQTS 被分为13 个类型，目前共发现1000 多个突变位点可以导致该病。最常见的是1型、2型和3型LQTS（LQTS1、LQTS2和 LQTS3）,占所有已知基因型LQTS 的91%。LQTS1是KCNQ1离子通道基因突变造成的，是最常见的一种LQTS，已经发现了333 个KCNQ1 突变位点可以导致该病。KCNQ1 基因编码缓慢激活延迟整流钾离子通道（Iks）α亚单位（通常称为KVLQT1 或KV7.1），具有6 个跨膜结构域（S1-S6），1 个具有离子选择性的P 环和位于胞内的N 端和C 端。该基因不同区域的突变导致不同程度的疾病表型。本课题利用CRISPR/Cas9技术建立1型LQTS的干细胞模型，研究干细胞模型是否能够预测突变位点与LQTS1 发病风险及用药剂量的关系。我们根据文献在KCNQ1上选择了7个病人特异的突变位点和1个做对照的多态性位点，设计了14个gRNA，验证了gRNA的活性。在此基础上每个位点选择了一个活性高度gRNA。我们同时设计了6个供体质粒，供体质粒上含有要引入的突变和筛选基因。将供体质粒和gRNA共转染到干细胞中，通过嘌呤霉素筛选出发生重组的细胞。我们成功的筛选到了5个含有特异突变的细胞系和1个含有多态性变异的细胞系，通过膜片钳技术分析发现这些干细胞分化得到的心肌细胞都有LQTS的表型，动作电位时程明显延长。在建立细胞系的过程中，我们发明了高效的基因编辑技术。我们利用附着体载体表达gRNA、Cas9和嘌呤霉素抗性基因。这个抗性基因可以筛选出转染成功的细胞。利用这个系统，我们实现了高效的基因编辑，在干细胞中的编辑效率达到了50-100%。我们也实现了高效的大片段基因组DNA敲除，纯合敲除的效率为～10%。这些工作为将来的研究打下坚实的基础。