猪肝细胞质膜戊肝病毒受体筛选、鉴定和结构分析

猪戊型肝炎（SHE）是由猪戊型肝炎病毒（SHEV）引起的粪－口传播的一种人畜共患病，人和SHEV可交叉感染，已成为各国密切关注的公共卫生问题。迄今为止，对SHE流行病学、人畜交叉感染、SHEV分子生物学及诊断技术等进行了深入的研究，但对SHEV受体的研究还没有报道。本项目拟在申请人克隆与表达SHEV-ORF2类病毒颗粒及制备单抗等的研究基础上，用密度梯度离心和多聚物双水相方法分离富集肝细胞质膜，提取膜蛋白。然后结合病毒铺敷蛋白印迹技术，蛋白质化学交联和免疫共沉淀等相结合的方法筛选病毒候选受体。再用病毒受体重建、RNAi技术结合荧光定量PCR技术等鉴定候选受体的可靠性。最后采用蛋白质化学、生物质谱和生物信息学技术研究病毒和受体的相互作用、解析受体的基本结构。本研究的完成对于阐明SHEV与病毒相互作用、进入细胞的机制、致病机制等；对于设计抗病毒药物及避免异种器官移植的交叉感染具有重要意义。

本项目完成了项目研究计划中的全部内容，基本达到了预期目标。通过表达的重组类病毒颗粒与重组聚体蛋白，对蛋白的表达条件给予了合理的优化，然后通过蛋白质方法、免疫学方法、原子力显微镜和透射电镜法等先进手段研究了蛋白的主要性质，确定表达的蛋白模拟了病毒的高级结构，尤为重要的是，重组的类病毒颗粒模拟了病毒的中和表位，具有很好的免疫反应性和免疫原性。我们也通过实验，探索并建立了成熟高效的原代肝细胞培养体系，建立了细胞膜的分离和纯化技术与方法。在此基础上建立了全细胞和重组蛋白孵育交联的蛋白相互作用免疫共沉淀、膜蛋白和重组蛋白孵育交联的蛋白相互作用免疫共沉淀技术，进而采用质谱技术鉴定了沉淀蛋白，最后采用SiRNA干扰技术验证了筛选到的蛋白可以认为是病毒的受体。该蛋白的发现，将为今后进一步研究不同基因型病毒感染宿主的差异性机理打下了一定的基础。.在本项目的实施过程中，主持人由副教授晋升为教授，项目主要骨干、湖南师大医学院第一附属医院（省人民医院）吴意由副主任技师晋升为主任技师，公开发表学术论文5篇，校样《生物工程学报》论文1篇，申请国家发明专利2项，其中1项获得国家专利局授权；主持人独立指导培养硕士研究生两人，协助指导湘雅二院博士生1名，协助指导硕士生2人。.本项目的研究结果大部分尚未整理成论文发表（有1篇论文已投稿被生物工程学报接受并已经校稿，尚有1-2篇SCI论文在整理中），将在2014年尽快撰写论文发表。