莲心碱影响膀胱癌细胞增殖的相关microRNA机制研究

Chinese Herbal Medicines play important roles in malignant tumor therapy. The illustration of Chinese Herbal Medicines exactly anti-cancer mechanism will provide useful guide for its administration. Recently, the association between Chinese Herbal Medicines effects on cancer cells proliferation and microRNA epigenetic events is emergence to the front of this field. In our previous study, we found that liensinine (it belongs to bisbenzylisoquinoline family which was purified from lotus plumule) could inhibit bladder cancer cell line T24 proliferation and stop it at G1/S cell cycle phase, meanwhile, liensinine could also up-regulated the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 expression and down-regulated miR93 expression. In this project, we will finish the following experiments:1. Confirming liensinine anti-cancer activity on built bladder primary tumor tissue culture system. 2. Using RNA interference technique, we will illustrate liensinine regulating cell cycle through p21 gene expression. 3. We will investigate p21 associating microRNA regulator which influenced by liensinine through microRNA array and lentivirus expression system, it will declare the molecular mechniasm of liensinine inhibiting bladder cancer cell proliferation. The performance of this project will enrich the molecular mechniasm for Chinese Herbal Medicines anti-cancer activity and shed a beacon light on liensinine usage in malignant tumor therapy.

中药在恶性肿瘤治疗中的作用日益重要，明确其抗肿瘤机制将会使中药得到更为广泛的抗癌应用。但目前中药对肿瘤细胞增殖相关microRNA影响的研究却鲜有报道。在前期研究中，我们发现莲心碱（中药莲心中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱）可以抑制膀胱癌细胞T24增殖，其将膀胱癌细胞阻滞于G1期并上调细胞周期调控蛋白P21的表达，同时抑制P21调控microRNA--miR93的表达。以此为基础，本课题将：①通过膀胱癌组织原代培养平台，进一步证实莲心碱对膀胱癌的抑制作用；②通过RNA干扰技术，明确莲心碱对膀胱癌细胞周期的调控作用是通过调控P21蛋白表达而实现；③通过microRNA芯片筛选及慢病毒表达技术，明确莲心碱对P21相关microRNA调控网络的影响，明确莲心碱抑制膀胱癌细胞增殖的分子机制。本研究的完成，将进一步丰富中药抗癌的分子机制，为莲心碱在抗癌治疗中的应用提供确切的理论与实验基础。

中药在恶性肿瘤治疗中的作用日益重要，明确其抗肿瘤机制将会使中药得到更为广泛的抗癌应用。本课题研究通过体外及体内实验，证实了莲心碱对细胞增殖具有明显的抑制作用。莲心碱明显阻滞了膀胱癌细胞的细胞周期，诱导膀胱癌细胞的细胞凋亡，并促进了膀胱癌细胞的自噬。进一步的研究发现，莲心碱促进p21蛋白与p27蛋白表达水平的明显上调，同时下调Akt的磷酸化水平；促进I 型微管相关蛋白轻链3（LC3-I）向II 型微管相关蛋白轻链3（LC3-II）的转化，并下调p62蛋白的表达；明显诱导细胞线粒体损伤，并明显上调AMPK蛋白与Raptor蛋白的磷酸化水平。这提示着莲心碱抑制细胞增殖的作用机制呈多样性。同时测序分析结果提示，莲心碱干预膀胱癌细胞后，出现明显的基因表达改变。T24细胞组基因上调925个，下调31个；T24细胞组与5637细胞组共同改变的基因数为764个。GEO富集分析显示，莲心碱干预膀胱癌细胞后，膀胱癌细胞的分子功能，生物过程和细胞组成均发生了显著的变化。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是整合了基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库。莲心碱干预膀胱癌细胞后，包括细胞骨架调控在内的诸多通路发生了明显变化。microRNA测序分析结果提示，莲心碱干预膀胱癌细胞后，出现明显的表达改变。T24细胞组上调2个microRNA，下调8个microRNA；5637细胞组上调2个microRNA，下调3个microRNA。T24细胞组与5637细胞组共同改变的microRNA为miR-30a-5p、miR-30e-5p、miR-1-3p、miR-143-3p。