外泌体miRNA介导蜕膜细胞自噬在自然流产中的作用机制及补肾安胎中药的干预研究

Spontaneous Abortion is a common reproductive disturbance，the dysfunction of decidual cells in maternal fetal interface can be an important pathogenesis of it. Our previous studies showed that Modified Shoutai Wan not only has the protective role to decidual cells, but also can reduce the level of autophagy in decidual cells. What's more, we also found that the expression of miRNA-198 is low in serum exosome and decidual tissue, while the expression of ATG9B is high. New researches were reported that exosomes secreted from trophoblast cells can regulate the cell function of maternal fetal interface. Therefore, it is hypothesized that Modified Shoutai Wan can decrease ATG9B expression in decidual cells by upregulating the expression of exosomal miR-198, which released from trophoblast cells, resulting in inhibition of autophagy that can improve decidual cell function and achieve the aim of tranquilizing fetus to prevent miscarriage. Based on the theory of kidney governing reproduction, taking exosomal miRNA as the breakthrough point, we integrate the traditional Chinese medicine pharmacology, bioinformatics, molecular biology method to conduct our research and we verify our research from in clinical clinical studies to in vitro and in vivo, in order to clarify the mechanism of miRNA-198 in regulating autophagy and the molecular mechanism of Modified Shoutai Wan on treating SA throngh the miRna、mRNA、protein、ultrastructure、tissues and organs.

自然流产（SA）是常见的孕育障碍，母胎界面蜕膜细胞功能失衡是SA发生的重要机制。前期课题组研究表明减味寿胎丸对SA蜕膜细胞有保护作用且能降低细胞自噬水平；同时发现SA患者血清外泌体（exosome）和蜕膜组织中miRNA-198均呈低表达，而自噬基因ATG9B高表达，并通过生物信息学分析提示ATG9B为miR-198调控靶基因。最新文献报道滋养细胞分泌外泌体影响母胎界面细胞功能。故提出假说：减味寿胎丸可能通过调控滋养细胞分泌外泌体miRNA-198介导蜕膜细胞ATG9B表达，下调其自噬水平，改善蜕膜细胞功能达到补肾安胎的作用。基于肾主生殖理论，以exo miRNA为切入点，整合中药药理、生物信息学、分子生物学方法，采用临床-体外-体内实验互相佐证，从miRNA、mRNA、蛋白、超微结构和组织器官系统阐明外泌体miRNA-198调控自噬表达作用机制，阐释减味寿胎丸治疗SA的具体分子机理。

母胎界面细胞自噬平衡是维持妊娠的重要前提。前期研究发现补肾代表组方减味寿胎丸能抑制SA母胎界面细胞过度自噬，而SA患者血清外泌体miR-198、绒毛组织ATG16L1及ATG9B存在差异表达，通过生信分析提示miR-198能靶向调控ATG16L1、ATG9B表达。故本项目从临床-体外-体内三个方面围绕减味寿胎丸调控外泌体miR-198介导母胎界面细胞自噬的机制开展研究:①临床验证：经临床50对样本验证发现SA患者血清外泌体miR-198高表达，绒毛组织中miR-198低表达，ATG16L1及ATG9B高表达，自噬增强与SA结局正相关。同时发现SA绒毛组织中FTO表达降低，m6A异常累积；②体外实验：以HTR-8/SVneo细胞及原代蜕膜细胞为研究载体，运用双荧光素酶报告基因明确miR-198与ATG9B、ATG16L1可靶向结合；并成功提取了SA患者血清外泌体（SA-exo）、减味寿胎丸干预HTR-8/SVneo细胞来源外泌体（JW-exo），并分别加入HTR-8/SVneo细胞及原代蜕膜细胞中，发现SA-exo能够增强HTR-8/SVneo细胞自噬；减味寿胎丸能够调控滋养细胞来源外泌体miR-198，抑制原代蜕膜细胞ATG16L1及ATG9B表达，同时能激活PI3K-AKT-mTOR通路抑制细胞过度自噬。③体内实验：以肾虚流产SD大鼠模型为研究载体，从宏观-组织-基因-蛋白系统阐明减味寿胎丸可激活PI3K-AKT-mTOR通路，抑制流产大鼠母胎界面过度自噬从而降低流产率达到补肾安胎的效果，且发现其能够抑制流产大鼠子宫蜕膜组织铁死亡现象。.本研究发现外泌体miR-198可作为SA诊断标志物之一，miR-198低表达导致靶基因ATG9B、ATG16L1过表达可引起母胎界面自噬增强。阐明了补肾代表组方减味寿胎丸可通过促进滋养细胞分泌外泌体miR-198抑制早孕蜕膜细胞ATG16L1及ATG9B表达，下调母胎界面自噬水平，保护细胞分泌功能，从而达到补肾安胎的作用，进一步丰富“肾主生殖”的科学内涵。本研究已发表相关SCI 3篇，中文核心2篇；培养博士生3名（已毕业1名），硕士生1名（已毕业）。项目负责人在项目执行期间入选全国中医药创新骨干人才培训项目培养对象（2019年）及国家重点学科“中医妇科学”学术带头人（2020年）。以第三完成人获得省部级科技进步奖2项。