羧化和非羧化骨钙素在骨重建过程中的作用研究

Osteocalcin plays a vital role in the crosstalk between bone and other tissues, which is becoming a focus of the biomedical research. But the exact function of osteocalcin in the balance regulation of bone metabolism is still controversial. The major reason is that there are two forms of osteocalcin (carboxylated and undercarboxylated) and their function during bone remodeling is far from clear. Based on recent reports and our newest research results of undercarboxylated osteocalcin, we plan to develop a tissue specific gene knockout technique on the basis of CRISPR system; construct animal and cell models that knock out osteocalcin gene cluster or specifically secret undercarboxylated osteocalcin. MicroCT, three-point bending biomechanic analysis, RT-qPCR and histochemical stain will be used to study the role of carboxylated and undercarboxylated osteocalcin in bone remodeling balance between bone formation and resorption including bone development as whole, mechanical response to unloading conditions, activity and function of osteoblast, differentiation and maturity of osteoclast, and the mutual regulation between osteoblast and osteoclast. We aim to clarify the exact function and mechanism of carboxlated and undercarboxylated osteocalcin in bone remodeling process, which will provide theoretical basis for the hypothesis that carboxylation and undercarboxylation is a new regulation model for physiology system.

骨钙素在骨骼与其它组织器官间的交互调控是近来生物医学研究的热点，然骨钙素在骨代谢平衡调节中的作用依然存在很大争议，其关键是骨钙素存在羧化和非羧化两种形式，它们在骨重建过程中具体作用尚不清晰。基于当前非羧化骨钙素功能的挖掘和我们前期研究发现，发展基于CRTSPR系统的组织特异性基因敲除技术，构建骨钙素基因敲除和分泌非羧化骨钙素的动物和细胞模型，采用microCT、三点弯曲法、qRT-PCR、组织化学染色等方法，在动物整体、组织器官和细胞分子水平，从骨骼生长发育、力学响应重建过程、成骨细胞活性和功能、破骨细胞分化成熟、成骨和破骨细胞交互调控等方面，研究羧化和非羧化骨钙素对骨重建平衡的骨形成和骨吸收的影响，旨在阐明羧化和非羧化骨钙素在骨重建过程中的作用及其可能的机制；为证实羧化和非羧化这种生理系统新的调节模式的假说奠定坚实的理论基础。

骨钙素在骨代谢平衡调节中的作用依然存在很大争议，其关键是羧化和非羧化骨钙素在骨中的具体功能尚不明晰。本项目利用纯化的羧化和非羧化骨钙素，采用RT-qPCR、TRAP染色、肌动蛋白环染色以及甲苯胺蓝染色等方法在细胞组织水平首次发现非羧化骨钙素能抑制破骨细胞的增殖活性、迁移能力、分化成熟和骨吸收活性，进一步发现非羧化骨钙素对破骨细胞的分化抑制作用主要发生在分化早期，且证实在破骨细胞分化的各阶段都能表达非羧化骨钙素潜在受体GPRC6a。信号通路报告基因、激动剂、抑制剂和siRNA等实验结果表明非羧化骨钙素可通过GPRC6a降低SRE-、CRE-、ERK等信号通路活性，进而抑制成骨细胞的分化成熟。构建了骨钙素三基因全敲除的小鼠，股骨和尾椎骨的显微结构结构分析表明骨钙素确实能影响骨骼的发育；并首次提出这种效应与骨骼的发育进程和受力程度有关的观点。采用组织特异性启动子驱动Cas9表达的方法成功建立了采用转基因技术构建组织特异性基因敲除动物模型的方法，并实现了骨组织特异性GGCX的敲除。GGCX敲除鼠的葡萄糖耐受实验表明GGCX骨特异性敲除能改善小鼠的葡萄糖调节能力。基因表达和显微结构分析显示GGCX敲除显著抑制了骨形成相关基因的表达和显微结构参数下降，表明GGCX敲除能抑制成骨细胞的分化功能和骨形成能力。在正常和GGCX敲除的MC3T3-E1中过表达骨钙素实验结果表明羧化骨钙素能增强了成骨细胞MC3T3-E1的早期骨向诱导分化效应和钙化结节形成。而非羧化骨钙素不影响成骨细胞的增殖活性、迁移和分化成熟。在骨钙素过表达细胞株的VKDPs分析后认为在成骨细胞分化成熟矿化过程中可能是由多种VKDPs参与的动态平衡。这为我们下一步研究指明了新的研究方向。综上所述和前期文献报道，认为非羧化骨钙素能抑制破骨细胞的分化成熟和羧化骨钙素能促进成骨细胞的分化以及招募和诱导破骨细胞分化成熟，因此，认为骨钙素羧化和非羧化比例的平衡在骨骼发育、重建过程中扮演重要角色。