γ-谷氨酰基羧化酶对骨性关节炎软骨的保护及其机制的研究

Rencent reasearch demonstrated that Ca2+ crystal plays an important role in the pathogenesis of Osteoarthritis, and give rise to the development of novel therapies for the treatment of OA. cMGP was reported to be an important inhibitive protein in the formation of Ca2+ crytal, and GGCX is a key enzyme in the process of carboxylation. Foreign study showed that decrease of cMGP was associated with GGCX. Degeneration of cartilage was found to be related with GGCX in the previous experiment, and interference of GGCX in normal chondrocytes can increase apoptosis rate and expression of MMP13, collagen X. So we hypothesize that GGCX may have certain effect on protection of cartilage through inhibiting formation of Ca2+ crystal and regulating biological status of chondrocyte. In this study, in order to investigate the protective effect on cartilage and mechanism of GGCX from different angles,lentivirus was used to transduct GGCX in vitro and vivo, and then the following subjects will be discussed: 1. influence on Ca2+ deposition, formation of Ca2+ crystals and bone tissue form; 2. effect on apoptosis of OA chondrocyte; 3. expression of cMGP, ucMGP, GGCX, MMP13, collagen X, collagen Ⅱ, TNF and IL-1βin synovial fluid and cartilage also be detected.

研究表明钙离子晶体参与了骨性关节炎（OA）的发病，抑制其形成为OA的治疗提供了新的思路。羧化基质GLA蛋白（cMGP）是抑制钙离子晶体形成的重要蛋白，而γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)是MGP羧基化的关键酶。研究表明OA软骨中cMGP降低与GGCX减少有关，我们发现软骨退变程度与GGCX相关，干扰GGCX后正常软骨细胞的凋亡率、MMP13、 X型胶原表达均升高。我们认为GGCX可能通过抑制钙离子晶体形成、调节软骨细胞生物学状态及凋亡对软骨提供保护。本课题应用慢病毒介导GGCX基因进行体内、体外转染的方法研究：1、GGCX对钙离子沉积、软骨钙离子晶体形成及软骨下骨骨组织形态的影响；2、GGCX对软骨细胞凋亡率的影响；3、GGCX对关节液及软骨中cMGP、ucMGP、GGCX、MMP13、 X型及Ⅱ型胶原、TNF、IL-1β表达的影响，多角度探讨其对软骨的保护及作用机制，为临床应用提供理论基础。

项目背景：骨性关节炎的发病机制尚未完全明确，目前主要认为骨性关节炎的发生发展与软骨细胞凋亡、软骨细胞外基质失平衡、MMP13、IL-1β、TNF的分泌等有关，我们前期的研究结果表明GGCX的表达与骨性关节炎软骨的退变呈负相关，可能成为治疗骨性关节炎的潜在生物靶点，因此本研究的目的是探讨GGCX对骨性关节炎软骨的保护及其作用机制。.主要研究内容：应用慢病毒介导GGCX基因转染软骨细胞进行体内、体外实验。体外实验：分离兔OA软骨细胞，利用茜素红染色进行鉴定，分为空白组、空载体组和转染GGCX组，分别检测各组细胞凋亡情况以及基质中钙结节形成情况，PCR和western-blot检测GGCX、MMP13、X型胶原、Ⅱ型胶原、TNF、IL-1β的表达情况。体内实验：应用切断兔膝关节前交叉韧带的方法制作骨性关节炎模型，根据注入关节腔的成分不同分为：手术但未切断前叉韧带组、GGCX慢病毒液+ACLT组、生理盐水组+ACLT组、空病毒液+ACLT组，分别对关节软骨进行染色，并应用ELISA、PCR、western-blot方法检测cMGP、ucMGP、MMP13、X型胶原、Ⅱ型胶原、TNF、IL-1β的表达情况。.重要结果及关键数据：体外实验：成功分离了OA软骨细胞，转染组软骨细胞基质中钙结节明显增多，Ⅱ型胶原和GGCX表达显著升高（P<0.05），而MMP13、 X型、TNF、IL-1β1的表达及细胞凋亡率显著下降具有统计学意义（P<0.05）。体内实验：成功制作了兔骨性关节炎模型，GGCX慢病毒液组关节软骨的退变明显减轻，GGCX转染组，Ⅱ型胶原和cMGP表达显著升高（P<0.05），而ucMGP、MMP13、 X型、TNF、IL-1β1的表达显著下降具有统计学意义（P<0.05）.科学意义：体外慢病毒介导GGCX转染骨性关节炎软骨细胞后可调节软骨细胞的基质平衡，抑制软骨细胞的凋亡，减少炎症因子的分泌，体内将GGCX慢病毒液注入兔膝关节骨性关节炎模型后可抑制软骨的退变，表明GGCX对骨性关节炎软骨退变具有抑制作用，为GGCX治疗骨关节炎的临床应用提供理论依据。