聚乙二醇化聚乙烯亚胺-腺病毒复合策略，构建长效、低免疫原性、肿瘤靶向基因载体的基础研究

Although system delivery of oncolytical adenoviral vectors have been regarded as a promising stratge of tumor treatment to date, several issues still need to be addressed, such as fast clarence from the blood and immune response to the virus. Here we propose that, modified by the linear polyethylenimine - poly ethylene glycol (PEI-PEG-PEI) triblock copolymers, a "long lasting and low immunogeneicity" hybird polymer-adenoviral gene delivery vector can be constructed. By the cationic effect, the polymers can softly anchor to the viral surface, presenting the antibodies from recognizing the viral antigens, thus extend the viral half-life and reduce the immune response. Then, the polymers will disassociate from the virus slowly, the exposed envelope protein can bind the virus to the specific cellular receptors on the tumor surface. Additionally, the cyclic arginine-glycine-aspartate (cRGD) peptide, a selective αvβ3 integrin ligand, will be linked to the distal end of some polymors, constructing PEI-PEG-RGD trimers, to further enhance the tumor selectivity and transgenic efficacy of the virus, together with the electrostatic interactions of PEI. We plan to optimize the synthesis conditions of the triblock polymers, construct the polymer loose encapsulated Ad5 vector then characterize it. To test our hypothesis, the transgenic efficacy will be evaluated by florescence microscopy and flow cytometry, the viral blood clarence and anti-viral titer will be tested in rats, anittumor effect will also be evaluated, via xenograft mice model.

溶瘤腺病毒的全身用药一直受到其在体内快速代谢和机体免疫反应的限制。我们提出以双侧聚乙烯亚胺修饰的聚乙二醇多聚物（PEI-PEG-PEI）物理吸附策略，构建"长效、低免疫原性"肿瘤靶向的溶瘤腺病毒复合基因载体。PEG经PEI的静电作用包裹于病毒表面，产生延长半衰期，降低免疫原性的作用，较弱的物理作用使PEG逐渐脱离，暴露出病毒表面，减少对病毒-细胞表面受体相互作用的阻碍。同时，在部分PEG外侧连接RGD环肽，利用其肿瘤靶向作用，配合少量外侧PEI的静电吸附，干扰肿瘤细胞膜的稳定性，进一步增强治疗性基因的转染效率。我们拟优化病毒载体的"疏松包裹"工艺，然后表征，考察粒径、表面电荷、形态、稳定性等参数，利用荧光显微镜和流式细胞技术研究携带基因的转录效率，在大鼠体内考察清除半衰期、抗病毒抗体滴度，在小鼠肺转移瘤模型上研究抗肿瘤作用来验证我们的策略是否可行。

为开发可全身用药的溶瘤腺病毒药物，我们提出了“疏松包裹”和“多重靶向”的思路，利用带正电荷的高分子聚合物PEI-PEG-PEI静电吸附，松散结合在病毒表面，减少包裹层对病毒细胞亲和作用的影响，再利用PEI的细胞膜稳定性干扰作用，提高穿入效率；利用聚合物末端携带的叶酸FA对叶酸受体高表达肿瘤细胞的特异性，配合病毒的肿瘤靶向启动子，定向的控制病毒复制、基因转录。. 经过对合成、制备路线的摸索和优化，我们合成了三嵌端的PEI-PEG-PEI和FA-PEG-PEI聚合物，筛选出PEI的最适分子量（2.8k），聚合物中叶酸FA和PEI的摩尔比(4:1)，以及聚合物与被包裹病毒的摩尔比等参数，制备了聚合物包裹的腺病毒，粒径分布在250-350nm左右，表面电荷约1.2-1.5mV，球状颗粒，体积均一，且分布较为均匀。随后分别在SK-OV-3及KB肿瘤细胞系中，我们观察到聚合物包裹病毒的转染效率（GFP荧光强度）远远高于裸病毒。包裹病毒免疫的小鼠抗血清和裸病毒Ad-GFP孵育后感染细胞，其荧光强度显著高于裸病毒免疫的小鼠，证明了聚合物的免疫屏蔽功能。荷瘤小鼠接受了3次包裹病毒的静脉给药，0.5×1011PFU，对肿瘤的抑制作用明显强于裸病毒，验证了其抗肿瘤活性的差别。同时，在肿瘤组织中发现了远远高于传统病毒靶器官肝脏的病毒基因，也证明了其靶向作用。项目进行过程中，我们申请了一项发明专利，主要保护聚合物的制备、FA和PEI的比例和聚合物与病毒的配制方法；参与实验的一名研究生获得了硕士学位；数据整理的学术论文正在撰写，因工具病毒的滴度出现突发问题，还需要补充部分活体成像显像结果后投稿。.必须指出，聚合物的合成路线较长，工业化生产的条件苛刻，而且物包裹病毒载体的过程，所需条件既要温和，又要可控，还要考虑包裹效率的水平和包裹体的均一性，符合GMP规范的难度较大，客观讲，短期内很难继续考虑往“药品”方向推进。我们正在考虑另外一条比较容易控制工艺的路线，即采用活的免疫细胞来包裹，配合肿瘤特异启动子控制的治疗性溶瘤病毒。即用技术成熟的溶瘤病毒（国内企业临床2期阶段）穿入技术成熟的肿瘤免疫细胞（CIK），回输达到作用部位后释放病毒，感染肿瘤细胞并复制，把问题简化为如何提高病毒对培养的肿瘤免疫细胞的感染效率，如何控制病毒的“静默期”，如何控制回输细胞的体内动力学行为。