甘草酸功能基因拷贝数组合多态性对甘草酸含量的作用机制研究

栽培甘草质量低于野生甘草是甘草资源可持续发展的瓶颈，也是中药资源领域亟待解决的关键科学问题。基于甘草酸功能基因的研究是解决该问题的创新性思路，单核苷酸多态性已部分揭示了其分子机制，申请者新发现的拷贝数多态性可能是新的突破口。.本课题在"甘草酸功能基因拷贝数组合多态性影响甘草酸含量"的新观点指导下，利用大样本、多基因的real time PCR 和Southern杂交的组合技术研究甘草酸高低含量组的拷贝数多态性，筛选高含量甘草酸的特异拷贝数组合，构建表达载体，培育工程菌或基因修饰植物，再通过real time PCR和GC-MS技术分别检测基因表达和催化效率，最终阐明甘草酸含量变异的功能基因拷贝数组合多态性分子机制。在新思路引导下的课题成果将为以甘草酸含量为目标的分子育种奠定基础，所提出的新观点和新思路对中药药效成分分子育种理论具有重要意义，对提高栽培甘草及其他中药的质量具有良好的应用前景。

本课题在“甘草酸功能基因拷贝数多态性影响甘草酸含量”假说指导下，在两个层面揭示功能基因拷贝数对其代谢产物的影响。（1）整体植物层面：采集不同产地的甘草种子，在相同栽培条件下培育，在大样本取样基础上，利用HPLC法测定各甘草植株中的甘草酸含量，利用real time PCR检测各甘草植株中功能基因HMGR、SQS1及β-AS的拷贝数，寻找高甘草酸含量药材与关键功能基因拷贝数及拷贝数组合的相关性；（2）工程菌层面：构建酵母表达载体，将甘草的3个功能基因分别转入毕赤酵母GS115中，构建了含各功能基因不同拷贝数的毕赤酵母工程菌，利用HPLC法测定各工程菌中麦角甾醇的含量，从而分析甘草功能基因拷贝数和其代谢产物的相关性。取得了如下成果：. 1、新发现：发现了“功能基因拷贝数调控代谢途径有效成分含量”的新机制。（1）在整体植物层面：发现功能基因拷贝数组合中的B类型（β-AS+HMGR+SQS1=1+2+1）更有利于甘草酸的积累，而C类型（β-AS+HMGR+SQS1=2+1+1）不利于甘草酸的积累；（2）在工程菌层面：发现所有转基因毕赤酵母工程菌中麦角甾醇的含量均高于空白菌株，且随着功能基因拷贝数的增加，毕赤酵母工程菌中麦角甾醇的含量呈现先上升、再下降、再上升的趋势，说明功能基因拷贝数对其代谢产物的含量具有明确的影响。. 2、新技术和新方法：建立了研究药用植物功能基因拷贝数和有效成分含量相关性的技术体系。（1）建立了用于功能基因拷贝数检测的real time PCR方法，该方法灵敏、准确、高通量，适合于对天然植物中的基因拷贝数进行检测；（2）建立了利用功能基因拷贝数研究药用植物有效成分变化规律的新技术体系，即：首先测定药用植物有效成分代谢途径上关键功能基因的拷贝数，其次测定该植物中次生代谢产物的含量，最后分析二者间的相关性。. 3、应用价值：（1）本课题培养了药用植物功能基因研究领域的专业人才，促进我国该领域的可持续发展；（2）所获得的实验材料可作为进一步进行甘草新品种选育的原始材料，是进行甘草优良品种选育的重要基础。