从Beclin1介导的自噬与凋亡信号途径探讨解毒活血中药组分配伍抗AS机制研究

Autophagy and appoptosis play different roles at the different stage of atherosclerosis, but its deep mechanism is still need to explicit. Beclin1 as a regulator of both pathways has provided new thoughts for the study of their relationship and atherosclerosis therapy. On the basis of National Natural Science Foundation of China Youth Science Fund Project (81102721), this study takes ApoE（-/-） mice and human aortic endothelial cells, vascular smooth muscle cell and human macrophage as objects, adopts immunohistochemistry, Western Blot, real-time fluorescent quantitative PCR, Fluorescence microscope and plasmid transfection techniques, to observe the morphological feature changes, expression of Beclin1 and its influence on autophagy signal pathway （LC3-Ⅱ、mOTR、P62）and apoptosis signal pathway（bcl-2, bcl-xL, caspase-3）in vivo and vitro. To discuss the possible target spots, and provide experimental proofs for the clinical application of combination of Chinese herbal components based on stasis-toxin theory on the treatment and prevention of atherosclerotic diseases.

自噬与凋亡在 AS 不同阶段发挥不同作用，但其具体机制仍需进一步阐明。Beclin1作为一个同时参与自噬与凋亡双重程序性细胞死亡过程的调节因子，为研究二者之间的联系及AS相关疾病防治提供了新的思路。在前期国家自然科学基金（81102721）研究的基础上，本项目以ApoE（-/-）小鼠、人主动脉内皮细胞、主动脉血管平滑肌细胞和人巨噬细胞为研究对象，采用免疫组化、Western Blot、实时荧光定量PCR、透射电镜及质粒转染等技术，从体内和体外两个途径观察AS不同阶段自噬、凋亡的形态学特征变化，Beclin1的表达水平及其对自噬信号途径（LC3-Ⅱ、mOTR、P62）和凋亡信号途径（bcl-2、bcl-xL、caspase-3）的影响和相关性，探讨基于中医“瘀毒”理论的中药组分配伍（虎杖苷配伍山楂总黄酮）可能的作用靶标，为该组分配伍临床用于AS相关疾病的防治提供实验依据。

Beclin-1介导的自噬信号途径和凋亡信号途径与动脉粥样硬化（AS）及其斑块稳定性密切相关。前期优选出解毒活血中药组分配伍（虎杖苷配伍山楂总黄酮），防治颈AS疗效肯定。本课题以Beclin-1介导的自噬信号途径和凋亡信号途径为切入点，体内实验以ApoE-/-小鼠AS模型为研究对象，体外实验以人主动脉内皮细胞、人主动脉平滑肌细胞，人巨噬细胞AS模型为研究对象，采用免疫组化、免疫荧光、Western-blot、实时荧光定量PCR等技术，观察基于中医"瘀毒"理论的虎杖苷配伍山楂总黄酮对AS易损斑块病理形态学，自噬及凋亡形态学的影响，对AS易损斑块中Beclin-1的表达水平及其对自噬信号途径（LC3BII/Lc3BI、mTOR、P62）和凋亡信号途径（Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-3）的影响和相关性，探讨基于中医“瘀毒”理论的中药组分配伍（虎杖苷配伍山楂总黄酮）可能的作用靶标，以期为 AS 的防治提供新的切入点和研究思路。研究结果发现解毒活血中药组分配伍（虎杖苷配伍山楂总黄酮）可明显改善ApoE-/-小鼠AS模型血脂水平，缩小斑块面积，并可通过上调Beclin-1的表达，促进自噬信号通路，抑制凋亡信号通路，表现为可升高自噬相关因子LC3BII/Lc3BI表达，降低自噬相关因子mTOR及P62表达，可升高凋亡抑制因子Bcl-2及Bcl-xL，降低凋亡促进因子Caspase-3的表达。可能机制是虎杖苷配伍山楂总黄酮促进了Beclin-1-Bcl-2二聚体的解离，引起Beclin-1和Bcl-2的大量释放，Beclin-1大量释放进一步激活自噬过程，Bcl-2大量释放进一步抑制凋亡过程，从而发挥抗AS或延缓AS进展的作用，阐明了解毒活血中药组分配伍稳定AS易损斑块的效应机制，完善了AS“瘀毒”病因病机理论，丰富了解毒活血防治AS的科学内涵，为创新研发抗AS中药提供实验依据，对提高AS及相关疾病的中医及中西医结合防治水平具有重要意义。