毕赤酵母多不饱和脂肪酸生物合成相关脱氢酶基因的功能及其分子调控机制的研究

PUFAs play crucial biological roles in various organisms. The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been proved to be an excellent system for high-level expression of heterologous proteins because of many advantages. Our early analysis of fatty acid composition in P.pastoris GS115 indicated that it has a fatty acid profile which mainly includes two types of saturated fatty acids (SFAs), palmitic acid (PAM, C16:0) and stearic acid (STA, C18:0), two types of monounsaturated fatty acids (MUFAs), palmitoleic acid (C16:1n-7) and oleic acid (OLA, C18:1n-9), and two types of PUFAs, linoleic acid (LNA; C18:2n-6) and α-linolenic acid (ALA; C18:3n-3). Therefore, unlike the yeast Saccharomyces cerevisiae, which has only one desaturase (△9 FAD) encoded by OLE1 gene, P.pastoris possesses a relatively complete system of PUFAs biosynthesis. For all these reasons above, P.pastoris is a good eukaryotic model organism for studies on the metabolism and regulation mechanism of fatty acid biosynthesis. In an effort to elucidate the regulation mechanism controlling gene expression in the biosynthesis pathway of PUFAs of P.pastoris, we are willing to perform some experiments concerning the physiological role of the FAD gene product, changes in gene expression, cis-acting elements and potential regulatory protein on the molecular level. The results will facilitate a comprehensive understanding of the biosynthetic pathways and regulation mechanisms involved in the production of PUFAs and improve our understanding of their role in biofilms.

多不饱和脂肪酸（PUFAs）在生物体内具有重要的生物学功能，巴斯德毕赤酵母是目前表达外源蛋白的理想宿主。通过气相色谱法对其胞内脂肪酸组成分析后发现，毕赤酵母不仅含有16碳棕榈酸、18碳硬脂酸饱和脂肪酸；而且还含有棕榈油酸、油酸单不饱和脂肪酸以及亚油酸、α-亚麻酸多不饱和脂肪酸。因此它不同于酿酒酵母，其体内具有相对完整的PUFAs代谢系统，是研究脂肪酸代谢理想的模式菌株。本项目拟通过在分子水平上对其体内PUFAs生物合成途径中相关脱氢酶基因的功能、基因表达变化、基因启动子顺式作用元件和基因表达潜在的调控蛋白进行研究，旨在明确该模式菌株体内PUFAs合成过程中相关基因的表达调控机制，从而为全面阐述真核生物PUFAs生物合成途径及PUFAs在生物膜中的作用奠定基础，并且为真核生物PUFAs代谢及调控通路的研究提供一个简单的模型。

本研究构建了巴斯德毕赤酵母不饱和脂肪酸（UFAs）合成途径，鉴定了参与该途径的一系列蛋白，并阐述了UFAs在菌株应对外界环境压力时所发挥的重要功能。通过气相色谱法检测各脱氢酶基因缺失菌株胞内脂肪酸的组成，并鉴定了调控脱氢酶基因转录的转录因子Spt23。通过生长测定、Realtime-PCR、脂肪酸成分分析、ROS和MDA水平检测、透射电镜观察等方法，探究脂肪酸脱氢酶在低温、外源添加脂肪酸、氧化压力和质膜压力等外界刺激条件下所发挥的功能。通过构建一系列FAD9A基因启动子报告菌株，测定单位菌浓中GFP荧光强度，鉴定出FAD9A基因启动子序列中的低氧应答区域位于-90~-47 bp。通过生长测定、Realtime-PCR、细胞壁组分检测、ROS水平检测、显微观察、western blot、PI染色和ICP等方法，发现Spt23在细胞壁完整性、细胞膜稳定性和内质网功能维持方面发挥了重要的作用。发现UBX系列蛋白的缺失影响胞内UFAs合成，通过western blot检测缺失菌株中Spt23蛋白表达情况，发现UBX蛋白能维持Spt23蛋白的表达并协助Spt23蛋白的加工成熟。Nile Red染色和对脂滴蛋白表达量及定位的检测，显示UBX和UBX2的缺失会导致脂滴相关蛋白聚集缺陷，从而导致脂质积累缺陷，最终影响脂滴的形成。通过梯度稀释点板实验、ROS和MDA水平检测，发现ubx1Δ缺失菌株对H2O2敏感性增强。此外，通过阿拉伯糖醇添加测定菌株生长、胞内Na离子含量测定等实验，证明ubx2Δ缺失菌株对0.5 M NaCl敏感性增强是由于UBX2基因缺失导致了菌株对离子所造成的高渗透压敏感性增强。通过互补实验、构建双基因缺失菌株及转录组数据分析，发现UBX1的缺失以及UBX1和UBX2双基因的缺失对菌株的生物学功能影响更为严重，Ubx1或许扮演着更重要的角色。通过研究TiO2纳米颗粒和氧化型石墨烯两种纳米材料对巴斯德毕赤酵母损伤的毒理，证实了UFAs在维持细胞质膜性质、协助细胞抵御外界环境压力方面所起到的重要作用。综上所述，通过本研究构建的巴斯德毕赤酵母不饱和脂肪酸代谢途径，阐述了UFAs在维持菌株生长、应对外界环境刺激等方面的重要作用，为全面阐述真核生物UFAs生物合成途径及UFAs的生物学功能奠定基础，并且为真核生物UFAs代谢及调控通路的研究提供了一个简单的模型。