白念珠菌转录因子Aft2p的功能研究

对于器官移植、强化化疗、糖尿病、艾滋病患者来讲，白念珠菌的感染是导致入侵性真菌疾病的主要原因。其致病性是与白念珠菌形态转换及铁吸收代谢相关的。我们发现白念珠菌的基因组中存在参与酿酒酵母铁离子动态平衡的转录激活因子Aft2p。同时还发现该转录因子可能在铁代谢基因的表达调控和细胞形态转换过程中起重要作用。本项目将通过一系列分子生物学手段，研究CaAFT2基因的缺失对细胞生长、铁代谢基因的表达、形态学以及毒力方面的影响；Aft2p在调节菌丝特异性基因表达方面的特征以及鉴定出Aft2p转录因子的DNA结合元件等。通过对白念珠菌Aft2p转录因子功能的研究鉴定出一条新的菌丝形态转换的调控途径，这将会进一步加深对白念珠菌形态转换网络调控途径和铁代谢基因调控途径的认识。更重要的是，本研究所鉴定并识别的靶点可以用于介入治疗，对临床上治疗白念珠菌的感染和药物开发具有重要的理论和实际意义。

本项目首次证实白念珠菌基因组中存在参与酿酒酵母铁离子动态平衡的Aft型调控因子同源物CaAft2，通过一系列分子生物学手段探究了该转录因子在许多重要细胞过程中的作用。生物信息学分析表明，白念珠菌Aft2蛋白是一个潜在的转录调控因子。异源表达实验显示该蛋白能补救酿酒酵母Scaft1Δ缺失株在非发酵碳源和低铁条件下的生长缺陷，说明Aft2在调节细胞内铁离子代谢和平衡方面具有潜在作用。但该蛋白不能补救酿酒酵母Scaft1Δ缺失株非铁依赖性缺陷表型，例如细胞壁完整性、金属离子敏感性和pH值耐受性等。为了进一步阐述该调控因子的功能，利用PCR介导的同源重组技术构建缺失株。发现AFT2基因的缺失会显著降低胞内铁含量和细胞表面高铁还原酶活力。通过实时定量PCR和构建启动子报告基因系统，发现该基因缺失一方面会引起铁代谢基因MRS4、SIT1、SMF3和HAP43表达上调，另一方面也会引起FTR1、FET3、FRP1、CFL1、FET34等铁代谢基因表达下调，说明CaAft2是一种铁应答转录因子，具有双重调控作用，参与调控白念珠菌铁离子动态平衡过程。通过报告质粒定点突变技术，研究发现白念珠菌Aft2转录因子以基因剂量依赖性的方式通过CACCC保守应答元件调控铁应答基因的表达。采用粘附能力测定，絮凝实验以及疏水性测定实验，发现AFT2基因的缺失影响白念珠菌细胞表面特性。另外，该基因对于细胞应答氧化压力刺激也具有重要作用。AFT2的缺失会显著引起胞内活性氧等物质的聚集，从而显著提高胞内SOD酶活性。值得注意的是， Aft2因子在固体和液体菌丝诱导条件下具有不同的调控机制。在固体条件下，AFT2基因的缺失会显著降低菌丝特异性基因的表达，从而降低菌落丝状生长和侵入能力。而液体条件下，Aft2主要作为负向调控因子参与形态发生过程。该基因的缺失会显著上调多种菌丝特异性基因的表达水平，轻微增强菌丝的生长和聚集能力。菌丝诱导信号能够引起Aft2因子细胞内定位的改变，进一步证实Aft2因子在形态发生过程中发挥着重要调控作用。最重要的是，AFT2基因的缺失会显著降低菌株在小鼠系统性感染模型中的毒力。综上表明，白念珠菌Aft2调控因子是重要的毒力决定因素。本项目为临床白念珠菌的感染治疗和临床药物开发提供了新的理论依据。发表论文18篇，其中SCI收录11篇，核心7篇。参加国内学术会议6次，发表会议论文8篇。