CD基因修饰内皮祖细胞联合磁流体热疗靶向治疗肝癌的研究

The death rate of liver carcinoma ranks the 2nd of all cancers in China.To date, there are still no special stratagies for it's therapy. Suicide gene (Cytosine deaminase, CD) mediated biotherapy is a potential treatment method but lacks the specificity of tumor targeting, while the delivery time of prodrug needs to be optimized. With the advantage of high selectivity and thermal uniformity, magnetic fluid thermotherapy(MFH) can enhance therapeutic effect of other treatments. But it's own effect is limited.Our research will construct the recombinant lentivival vector Lenti-CD/Luc-eGFP containing cytosine deaminase(CD) gene and luciferase gene, arm human umbilical cord derived endothelial progenitor cells(EPCs) and label EPCs with superparamagetic iron oxide(SPIO) for liver carcinoma combining gene therapy and MFH. Associating the advantage of magnetic resonance imaging(MRI) and optics, we will trace the transplanting cells, instruct the administration of 5-Fc and evaluate the treatment effectiveness. This subject would offer a strategy for combining tumor targeted tracking, biotherapy associated with thermotherapy and evaluate the effectiveness for liver carcinoma and other malignant tumor.

肝癌位列我国恶性肿瘤死亡率的第2位，目前无特效疗法，自杀基因（CD）介导的生物治疗是潜在的有效手段，但缺乏肿瘤靶向性、对前体药物的给药时间尚需优化。利用纳米颗粒的超顺磁性进行的磁流体热疗具有高选择性和热均一性的优势，能增强其他治疗的效果，但其本身单一治疗效果有限。本项目拟：1、构建含自杀基因（CD）和荧光素酶基因（Luc）的重组慢病毒载体Lenti-CD/Luc-eGFP，将具有肿瘤靶向的人脐带血内皮祖细胞（EPCs）同时装载CD和Luc，体外标记超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO），联合进行肝癌的基因治疗和磁流体热疗；2、综合利用磁共振和光学成像的各自优势，示踪移植细胞、监测热疗温度、指导CD基因治疗前药5-氟胞嘧啶（5-Fc）给予时间、评价治疗效果。本项目将可能为肝癌的治疗提供一种集肿瘤靶向追踪、联合生物治疗与热疗于一体的综合治疗策略，并为肿瘤治疗的疗效评价提供一种崭新的分子影像学手段。

背景：肝癌目前无特效疗法，自杀基因（CD）介导的生物治疗是潜在的有效手段，但缺乏肿瘤靶向性。本研究将具有肿瘤靶向的内皮祖细胞（EPCs）装载CD，体外标记超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO），进行肝癌的基因治疗和磁共振活体示踪移植细胞、评价治疗效果。.内容：（1）构建携带胞嘧啶脱氨酶（Cytosine Deaminase,CD）基因的慢病毒载体。.（2）应用纳米磁粒子Resovist体外标记小鼠骨髓源内皮祖细胞( EPCs )， 磁共振( MR ) 对标记细胞成像。免疫荧光及QPCR检测培养细胞表面标记及内吞Di I标记的乙酰低密度脂蛋白( Di I—AcLDL)和结合F I T C标记的荆豆凝集素一1 ( FITC—UEA一1)的功能，观察细胞体外成管情况。7.0T MR进行快速小角度激发（Fast Low Angle Shot，Flash）2D-FLASH序列和多自旋回波序列（multislice, multiecho，MSME)及不同数量级标记细胞群成像。.（3）慢病毒载体Lenti6.3-CD-EGFP转染、SPIO标记EPCs。观察细胞成管功能、迁移能力、检测各组细胞培养上清对小鼠肝癌细胞H22增殖能力影响。制作小鼠肝癌模型，尾静脉注射DID（荧光染料）标记EPCs至肝癌小鼠后进行光学成像观察EPCs体内迁移情况。尾静脉注射负载自杀基因的EPCs至肝癌小鼠。根据MR图像绘制肿瘤生长曲线；进行组织病理学分析、生存分析。.结果：（1）培养细胞表达内皮细胞标志CD31、KDR、vWF，能结合UEA、内吞LDL，体外基质胶上可以形成管状结构。Resovist细胞标记率接近100％。MRI显示标记Resovist的细胞群较未标记者T2*梯度回波序列信号降低。.（2）Lenti6.3-CD-EGFP转染EPCs后见细胞呈绿色荧光。DID标记EPCs后显示EPCs尾静脉注射后短期内主要分布于肝。EPC+SPIO+CD/5-Fc组细胞上清对H22体外增殖具有明显抑制作用；小鼠肝癌肿瘤体积小、增长速度慢，中位生存期延长。.结论：成功构建CD基因慢病毒表达载体并培养内皮祖细胞，Resovist能高效标记EPCs，利用MR可进一步实时活体监测。负载CD基因的EPC体外可以杀伤小鼠肝癌细胞H22、抑制其增殖，尾静脉回输后可以归巢于肿瘤组织，抑制肿瘤生长、延长肿瘤小鼠中位生存期。