发酵蔬菜潜在腐败启动因子——植物乳杆菌的乳酸代谢转变规律和分子机制研究

Microbial spoilage is always an urgent problem to be solved in the industrial vegetable fermentation. Lactobacillus plantarum is the important bacteria in fermented vegetable and was always regarded as an inhibitor against spoilage microorganisms. Preliminary studies of our group suggested that L. plantarum was related to the deterioration of fermented vegetable. Novel viewpoint is proposed in this project that L. plantarum, especially the L. plantarum with pellicle form, might transit the metabolic pathway from lactate production by sugar fermentation to utilization of lactate as carbon source for growth. The lactate utilization could initiate or improve the spoilage of fermented vegetable. Thus, the in situ cultivation and model broth with high fidelity to environment of fermented vegetable were designed for the growth of Lac. plantarum. By gene expression profile microarray, realtime fluorescence quantitative PCR, chromatographic analysis and microscopic examination, the planktonic and pellicle forms of L. plantarum will be monitored. The pattern and molecular mechanism of lactate metabolism in L. plantarum with different forms will be clarified. The impact of lactate metabolic transition on spoilage of fermented vegetable will be analyzed. The novel perspective and theoretic guidance will be provided in this project for spoilage control in starter fermented vegetable.

微生物腐败一直是发酵蔬菜产业迫切需要解决的重要问题。过去一贯认为植物乳杆菌作为发酵蔬菜中的重要微生物能够抑制腐败微生物的生长，但本项目组前期研究发现植物乳杆菌与腐败发生有关，提出植物乳杆菌特别是膜醭态植物乳杆菌可能从发酵糖产乳酸转变为利用乳酸代谢生长，启动或促进发酵蔬菜腐败。为此，本项目拟以发酵蔬菜为材料，建立具有发酵蔬菜高保真环境的原位培养和模拟培养方法，结合全基因组表达谱芯片、荧光RT-PCR、色谱分析和显微观察等手段，研究在蔬菜发酵、发酵后储藏和腐败过程中植物乳杆菌的群体形态特征和变化，阐明发酵蔬菜条件下浮游态和膜醭态植物乳杆菌乳酸代谢的转变规律和分子机制，分析植物乳杆菌乳酸代谢转变对发酵蔬菜腐败的影响，旨在为发酵蔬菜的腐败防控提供新思路和理论指导。

本研究以中国发酵蔬菜的典型代表四川泡菜为材料，重点研究了菌剂发酵和传统发酵、不同蔬菜原料、及不同氧气暴露条件下四川泡菜的发酵和腐败特点，特别是以植物乳杆菌为主的微生物群落结构和乳酸代谢特征。结果表明：①四川泡菜正常发酵过程中微生物以乳杆菌属、片球菌属、乳球菌属和肠杆菌属等为主，但不同蔬菜原料或不同氧气暴露条件下四川泡菜中的特征微生物及其相对丰度具有显著差异。不同条件发酵四川泡菜的前期，以植物乳杆菌为主的乳杆菌属占绝对优势，但植物乳杆菌在发酵中后期相对丰度逐渐降低。氧气暴露条件下，四川泡菜会发生以腐败膜醭、盐卤pH上升和不悦风味为特征的有氧腐败。有氧腐败过程中的微生物结构具有明显的空间和时序差异。腐败初期，植物乳杆菌在腐败膜醭中再次富集，其相对丰度先增高再随腐败进程减少，腐败后期不可检测。②四川泡菜正常发酵阶段，以植物乳杆菌为主的乳酸菌代谢糖类碳源生成乳酸，引起盐卤pH下降（降至3.5~4.0）。在有氧腐败初期，解淀粉芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌等在盐卤表面形成腐败膜醭，植物乳杆菌在腐败膜醭中富集获得氧气，同膜醭中微生物共同利用乳酸为碳源代谢产生醋酸等有机酸，使泡菜盐卤pH值上升0.5~1.5。③Pearson相关性分析表明，乳酸菌代谢糖产乳酸决定了四川泡菜发酵进程，特别在豇豆泡菜中以植物乳杆菌为主的乳杆菌属与乳酸生成和pH值下降相关性最显著，而泡菜风味化合物（可挥发性化合物、游离氨基酸）的形成与盐卤中低丰度微生物相关性更高。四川泡菜有氧腐败的启动伴随着植物乳杆菌由利用糖代谢产乳酸（乳酸发酵）到利用乳酸的代谢转变。研究认为在有氧条件下，当pH低于4.0，盐卤中总糖、还原糖分别低于2.0 mg/mL和1.0 mg/mL时，植物乳杆菌等膜醭中微生物启动消耗乳酸产醋酸代谢途径，缓解酸压力。pH4.5~5.0被认为是四川泡菜发生有氧腐败的转折点，腐败微生物大量富集且多样性达到最高。本项目研究结果可为发酵蔬菜的腐败防控提供新思路和理论指导。