植物乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌混合发酵改善豆豉风味的分子基础

Douchi which combined nutrient value with health function is a microbe-fermented soybean food. Flavor, to some extent, determines directly the quality of douchi and acceptance by consumers. Fermented douche with a pure Bacillus sp. will make douchi of single flavor and have ammoniacal odour at different degrees. In our previous studies, add lactic acid bacteria (especially Lactobacillus sp.) to fermented douchi with a pure Bacillus sp. as mixed-fermentation will improve significantly the flavor of douchi. With L. plantarum YM-5-2 and B. subtilis SP-8-5 as study material, we plan to compare and analyze the changes condition of volatile compounds and difference of gene expression between YM-5-2 separate fermentation and YM-5-2-SP-8-5 mixed-fermentation, and to screen candidate genes which probably related to flavor form from genome of YM-5-2, and to study the biological functions of partial key-candidate genes using gene knock-out technology. These studies will provide theoretical foundation for building pathway of synthesizing and douchi flavor compounds, and interpreting the molecular mechanism of improving douchi flavor with mixed-fermentation, and making douchi have both tasty and benefit health functions.

豆豉是集营养价值和保健功能于一体的大豆微生物发酵食品，风味在一定程度上直接决定豆豉的质量和消费者的可接受度。利用纯种芽孢杆菌（Bacillus）发酵豆豉，会使豆豉风味单一，且具有不同程度的氨味。在我们前期研究中，将乳酸菌尤其是乳酸杆菌（Lactobacillus）添加至Bacillus纯种发酵豆豉中进行混合发酵，能显著改善豆豉的风味。本项目拟选取L. plantarum YM-5-2和B. subtilis SP-8-5为研究材料，比较分析YM-5-2单独发酵和YM-5-2-SP-8-5混合发酵两种工艺条件下挥发性物质的变化情况和基因表达差异，从YM-5-2基因组中筛选出与风味形成相关的候选基因，利用基因敲除技术研究部分关键候选基因的生物学功能，为建立豆豉风味物质合成路径，诠释混合发酵改善豆豉风味的分子机制，使豆豉兼具味佳和益生两种功能提供理论依据。

本项目以贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SP-8-5和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）YM-4-3为研究材料，将其添加至蒸煮好大豆中，通过发酵工艺优化，获得了B. velezensis、Lb. plantarum单菌株发酵豆豉（Bv和Lp）和B. velezensis—Lb. plantarum双菌株混合发酵豆豉（BvLp）。感官评价结果显示BvLp风味比Bv和Lp好。利用顶空固相微萃取结合气质联用技术从Lp、Bv和BvLp中分别鉴定出26、28和34种挥发性化合物，且BvLp的酮、吡嗪和醇含量较单菌株发酵豆豉多，而酸和酯含量较Lp少。有趣地是，关键风味化合物乙偶姻和2, 3-丁二醇在BvLp中含量最多。这些化合物的改变可能是BvLp风味优于Bv和Lp的物质基础。为了揭示该现象的分子机制，利用RNA-Seq技术对3种豆豉中微生物的基因表达谱进行了分析，结果发现，3499和2674个基因分别在Bv和Lp中发生了转录；BvLp转录的基因分为2部分，其中3499个属于B. velezensis，2555个属于Lb. plantarum。基因转录水平比较分析表明，在BvLp vs Bv中，上调基因数大于下调基因数，而在BvLp vs Lp中，上调基因数小于下调基因数，说明BvLp中的B. velezensis和Lb. plantarum可能分别通过增加和减少相应风味化合物含量改变混合发酵豆豉风味。在BvLp vs Lp中，各种酸的GO terms显著富集结果表明：相对于Lp，BvLp中的Lb. plantarum可能通过降低参与酸代谢的各种基因表达减少酸的含量，从而减轻BvLp酸味。代谢路径分析发现，在BvLp vs Bv中，关键风味物质产生途径—支链氨基酸生物合成路径中的差异基因均是上调的；参与关键风味物质乙偶姻利用的5个基因中有4个表达水平显著上调，说明相对于Bv，BvLp中的B. velezensis可能通过加强支链氨基酸和乙偶姻的代谢改善BvLp风味。为了建立豆豉风味物质合成路径，乙偶姻、酸等重要风味物质代谢路径中的一些关键基因被选择出来，利用基因异源表达方法，对其生物学功能进行了研究。总之，我们的结果初步阐明了植物乳酸杆菌和贝莱斯芽孢杆菌混合发酵改善豆豉风味的分子机制，为使豆豉兼具味佳和益生两种功能提供理论依据。