血小板膜蛋白GPV酶切的调控机制及其在动脉血栓中作用的研究

血小板活化是导致动脉血栓性疾病的主要原因。有研究表明血小板膜蛋白GPV缺失的小鼠出血时间明显缩短、其血小板也对极低浓度的thrombin异常敏感，提示GPV极可能是血小板激活的负调控蛋白、在血栓形成中起到重要作用。由于GPV可以在血液中迅速被酶切，而我们前期工作也发现GPV的胞内部分可以调控GPV的酶切，因此我们提出假设：完整GPV蛋白的存在提高了血小板活化所需要的刺激剂的阈值，而GPV通过在血液中被迅速酶切促使血小板极易激活进而导致血栓生成。为明确GPV酶切在血小板活化及血栓形成中的作用，我们将首先研究GPV酶切的分子调控机制，并根据研究结果制备GPV酶切特异性的抑制剂及刺激剂，然后检测这些调控剂对体外不同刺激剂引起的血小板活化以及小鼠体内血栓形成的影响，从而阐明GPV酶切在血栓形成中的作用。本工作的完成将丰富血小板活化的分子机制理论，并为研发以GPV为靶点的新型抗栓药物提供理论依据。

本研究以血小板表面受体GPIb-IX-V复合物为研究对象，以体外转染哺乳动物细胞CHO细胞株为主要表达手段，结合纯化血小板及动物模型，通过研究GPIb-IX-V复合物中一个亚基GPV与其他亚基之间的相互作用及其酶切的调控机制，阐明GPV的表达调控机制及其在血小板活化及动脉血栓中的作用。研究主要发现：（1）GPV的跨膜区域、尤其是其内的三个极性氨基酸Y509/Q516/T520在GPV与其他亚基之间的相互作用中起到关键作用，而这一相互作用决定了GPV是否能在细胞膜上充分表达。将GPV的跨膜区整体替换或者将这三个极性氨基酸替换均会破坏GPV与其他亚基的相互作用从而显著降低细胞膜表面GPV的表达量。（2）GPV的胞内区域、尤其是K529/R535/K536对于GPV向细胞膜的转运及GPV在膜上的酶切调控中均起到重要作用。将GPV的胞内区域全部替换或者将这三个碱性氨基酸替换后，GPV在细胞膜表面的酶切显著上调、表达量显著下降。此外，我们的研究还发现GPV胞内区域对GPV酶切的调控是通过其与钙调蛋白（calmodulin）的结合实现的，当突变GPV与calmodulin的结合位点或者利用竞争性多肽破坏GPV与calmodulin的相互作用时，GPV在细胞膜表面的酶切显著上调。（3）GPV的酶切会影响凝血酶（thrombin）诱导的血小板的活化。我们研究结果表明当利用竞争性多肽破坏GPV与calmodulin的相互作用从而上调GPV的酶切时，可以引起血小板活化的thrombin的阈值降低；而利用抗体特异性抑制GPV的酶切则可以在抑制同等浓度thrombin引起的血小板活化，即GPV的酶切可以调控血小板对thrombin的敏感性。（4）在小鼠的动脉血栓模型中的初步实验结果表明，特异性上调GPV的酶切会加快动脉血栓的形成。综上所述，我们的研究结果和发现，阐明了GPV在细胞膜表面表达的调控机制以及GPV酶切对血小板活化的调控作用，不但丰富了血小板活化的分子理论，也为特异性调控膜蛋白受体的酶切提供可行方案。