USP13保护肝脏缺血/再灌注损伤的作用和机制研究

Extensive studies on mechanism causing hepatic ischemia/reperfusion injury (HIRI) have not been translated into effective strategies for clinic therapy. Targeting the decisive factors at early stage of HIRI that cause the subsequent inflammation and cell death is critical for development of novel therapeutic strategies. Our preliminary study has demonstrated that USP13 downregulation is tightly associated with HIRI. USP13 deficiency exacerbates HIRI phenotype. These observations suggest USP13 is a key factor protecting HIRI. We propose to verify the protective role of USP13 in HIRI by using USP13 knockout and transgenic mice. RNA-Seq analysis combining mass spectrometry analysis will dissect the USP13 substrates and underlying mechanisms. Through phenotype rescue, we will demonstrate that the USP13 substrates mediated the protective function of USP13 in HIRI. Finally, we will explore the possibility that interfering USP13 or its substrates through adenovirus infection or pharmaceutical intervetion may be a good strategy for HIRI therapy. This study will expand HIRI research to the ubiquitination/deubiquitination field and promote the exploration for the ultimate pathogenesis of HIRI. Our research will also provide scientific evidence for development of novel strategy and potential targets for HIRI therapy.

肝脏缺血/再灌注损伤（hepatic ischemia/reperfusion injury，HIRI）众多机制研究未能转化为有效的临床治疗策略；揭示早期HIRI事件中触发后续病理过程的决定性因素是研发新策略的关键。我们前期研究显示去泛素化酶USP13表达下调与HIRI密切相关，USP13缺失则显著恶化小鼠HIRI表型，表明USP13是保护HIRI的关键因子。我们计划利用USP13基因敲除和转基因小鼠及其原代肝细胞模型确证USP13保护HIRI的功能；采用RNA-Seq联合蛋白质谱的方法解析USP13的靶向蛋白和作用机制；通过表型拯救的方式阐释其靶蛋白介导USP13保护HIRI的功能；以腺病毒感染和药物干预方式探索靶向USP13及其靶蛋白治疗HIRI的策略。本项目实施将拓展HIRI研究领域，推动对HIRI疾病发生根本机制的探索，为开发新的治疗策略提供科学依据和潜在靶标。

肝脏手术造成急性肝脏缺血/缺氧损伤。肝脏肿瘤发生过程中血管输氧不足造成肿瘤慢性缺氧微环境。众多肝脏缺血/缺氧损伤机制研究未能转化为有效的临床治疗急性缺血/缺氧损伤策略，慢性缺血/缺氧对肝脏肿瘤发生的影响仍然有待进一步阐明。揭示肝脏缺血/缺氧损伤事件中触发后续病理过程的决定性因素，并探讨相关机制，是研发新策略、鉴定新靶点的关键。我们前期研究显示去泛素化酶USP13保护小鼠急性肝脏缺血/缺氧损伤。进一步研究表明，USP13表达在肝细胞癌中升高，与肝细胞癌病理分期分级正相关，是肝细胞癌预后不良因子。体外功能研究结果表明，USP13下调通过促进ROS诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。然而，USP13过表达并不能显著促进细胞增殖和克隆形成。体内裸鼠皮下异种移植成瘤实验也显示USP13过表达没有促进肝癌细胞皮下成瘤，USP13过表达甚至抑制myr-AKT和NRASV12诱导小鼠原发性肝癌发生。针对这个矛盾，我们通过筛选45个信号通路发现USP13过表达增强包括细胞周期、PI3K/AKT、低氧、Myc、抗氧化反应、TGFβ等多个通常促进肿瘤增殖的信号通路，也观察到HNF4、p53、干扰素等通常抑制肿瘤增殖的信号通路。免疫沉淀-蛋白质谱分析检测到CDK1、CDC20 、NAD(P)H脱氢酶１NQO1、谷胱甘肽S-转移酶A1(GSTA1)、超氧化物歧化酶SOD2、PRDX3；RNA-Seq比较USP13下调后的表达谱GSEA分析显示细胞周期、DNA损伤重组修复、p53和HIF1α等信号通路。这些结果能与信号通路筛选和蛋白质谱分析相吻合。同时，USP13高表达的肝癌中AXIN和CTNNB1的突变比率最高。于此一致，USP13通过去泛素化Hif1α的K532位点K48类型泛素化稳定Hif1α，阻止其通过蛋白酶体降解。综上所述，我们的研究表明USP13可能作用于多种底物，既有促进也有抑制肝癌细胞增殖，其净效应取决于底物在肝癌细胞中的相对效应的叠加或消弭，可能与肝癌细胞的遗传变异的背景相关。我们的工作将有助于推动对缺血/缺氧发生根本机制的探索，阐明肝癌的异质性以及肝癌的精准分型，可能为相关肝癌和缺血/缺氧损伤提供相应的治疗策略和作用靶点。