多层次系统研究SMN2基因表达的调控以开发治疗脊肌萎缩症的新途径

Spinal muscular atrophy (SMA), a fatal motor neuron degeneration disorder, is the most common genetic killer of infants.It is caused by reduced expression of the survival of motor neuron (SMN) protein. Humans have two paralogous genes SMN1 and SMN2 that encode SMN. The key difference between these two genes lies in a translationally silent nucleotide transition in SMN2 exon 7 (C6T)that reults in splicing defect of this exon; about 90% of SMN2 mature transcripts skip exon 7. The exon7-skipped transcript produces a truncated dysfunctional protein.In SMA patients, SMN1 is unable to express functional SMN due to point mutations or deletions in the gene; however, all patients still carry at least one copy of SMN2.The limited amount of full-length SMN produced by SMN2 cannot fully compensate for the loss of SMN1 but is essential for viability. Meanwhile, the presense of SMN2 in patients provides an ideal target for therapeutic intervention. Indeed, it has been a central theme in SMA drug development in recent years to identify molecules that promote SMN2 transcription or correct its exon 7 splicing through high-throughput screens. However,so far SMN2 expression regulation at levels including transcription,RNA splicing, RNA stability, and protein stability has never been systematically studied. In this project, we will conduct a comprehensive and systematic study of SMN2 expression at multiple levels using modern molecular technologies to develop new approaches to treating SMA.

脊肌萎缩症（SMA）是婴儿中常见致死性运动神经元退化疾病，因SMN蛋白表达量不足引起。人类有两个平行同源基因SMN1和SMN2皆编码SMN。两基因的关键不同在于SMN2外显子7的一个沉默碱基变化（C6T）导致其RNA剪接缺陷,约90%的转录终产物没有外显子7，而产生的截短蛋白没有功能。SMA病人由于SMN1基因发生突变不能表达正常蛋白，但皆携带至少一个拷贝的SMN2；SMN2表达的少量全长SMN尽管不足以补偿SMN1的缺陷，对患者的生存至关重要。同时，病人SMN2的存在为药物干预提供了一个理想的靶点。近年来，以SMN2为靶点、通过高通量筛选提高转录或纠正剪接缺陷的分子一直是SMA药物开发的热点。但至今尚未有对SMN2基因表达在转录、RNA剪接、RNA稳定性和蛋白稳定性多层次进行系统研究的报道。本项目我们拟用最新技术对SMN2表达在上述几个层面进行全面系统的研究,以期发现治疗SMA的新途径。

脊髓性肌萎缩症（SMA）是脊髓运动神经元退变引起的神经肌肉疾病，常见于儿童，发病率高达1/6000 – 1/10000，起因于SMN1基因的缺失或突变，导致其表达的SMN蛋白缺乏。人类还有另外一个表达SMN的基因SMN2, 但该基因存在RNA剪接缺陷，90%的mRNA外显子7发生跳跃、相应的蛋白无功能，只能表达少量的全长有功能蛋白。本项目旨在转录、RNA剪接、RNA稳定性、蛋白稳定性多个层次研究SMN2基因表达的调控，期望发现多种增加SMN蛋白表达的机制，为新药研发提供思路。其中纠正SMN2剪接错误最具有治疗前景，现在唯一治疗SMA的药物nusinersen也是以SMN2剪接为靶标。本项目我们构建多个小基因系统，进行高通量的筛选，发现多个促进基因转录，RNA剪接，RNA稳定性的小分子和化学修饰反义寡核苷酸(ASOs)，阐明数个调控SMN2剪接的分子机制。证实SMN2内含子6的-44位置是一个剪接沉默子，G-44A的转换导致SMN2外显子7列入减少20%。HuR蛋白结合在-44位置富含A/U的序列，起到抑制SMN2剪接的作用。少数患者在进化中的一个SMN2拷贝保留了-44G（不是-44A）导致HuR结合减少，SMN蛋白表达增加，因此症状得到缓轻。Nusinersen是一款反义核酸药物，通过小基因细胞株ASOs的大规模筛选，我们发现数个比nusinersen具有更好效果的ASOs，值得进一步在动物模型中检验。同时，我们构建了五碱基序列库，对所有五碱基序列进行全面的筛选，发现大量特异性的剪接调控序列，这一工作具有重要的应用价值，可以作为潜在目标用来构建双功能反义寡核酸药物。另外，我们发现革兰氏阴性细菌释放的脂多糖（LPS）能抑制SMN2的剪接，使得SMN蛋白进一步减少50%，结果提示SMA患者应避免细菌感染，特别是慢性感染，否则病情会加剧。LPS、一些小分子和ASOs调控SMN2外显子7列入的分子机制正在研究之中，对机制的阐明将有助于设计治疗SMA的新策略。