虫草多糖对TGF-β1介导的慢性肾功能衰竭作用机制研究

申请人在中药冬虫夏草治疗肾病的启示下,首次发现从中药发酵虫草菌丝体来源的虫草多糖具有较好的治疗慢性肾功能衰竭的作用，前期完成了临床前全部研究并已获得新药临床批件。本项目在虫草多糖主要药效学研究基础上，围绕虫草多糖治疗慢性肾病是否通过TGF-β1/Smad 途径，以细胞及动物模型，从RNA、蛋白质及组织水平多层面动态观察，特别采用细胞荧光转染和动物过表达模型，揭示虫草多糖作用信号途径及作用靶点，阐明其治疗慢性肾病的分子机理。在细胞模型中，与抗纤维化中药多糖相比较，探讨中药多糖的药理机制。拓展中药多糖药物应用新领域。在动物模型实验中，以虫草多糖作为TGF-β1的抑制剂，探讨其与肾素抑制剂、血管紧张素阻断剂联合用药治疗慢性肾病的分子机制。通过本项目的研究，将拓展对中药虫草性味功效科学内涵的理解；拓展中药多糖药物应用新领域；为临床合理、有效的应用虫草多糖治疗慢性肾病奠定理论和实践基础。

本实验室分离得到的虫草多糖，前期研究已完成其提取纯化、结构分析、质量标准的制订、药理毒理等临床前研究资料，并已获得新药临床批件。临床前研究结果显示虫草多糖对多种原因引起的慢性肾衰竭均有较好的治疗作用，为了进一步阐明虫草多糖治疗慢性肾功能衰竭的机理，在前期研究基础上，拟用细胞模型，从RNA、蛋白质及组织水平多维动态地揭示虫草多糖在体内的信号通路及多糖的作用靶点。本实验设计采用正常人肾细胞模型：人肾小球系膜细胞（HMC）。采用诱导因子PDGF-BB刺激细胞产生病变模型，主要运用MTT方法检测不同浓度，不同作用时间PDGF-BB对细胞的过度增殖作用，确定了刺激时间为24h，工作浓度为20ng/ml；采用MTT方法考察虫草多糖对PDGF-BB诱导的HMC细胞过度增殖的抑制作用。实验考察了不同浓度虫草多糖分别预保护0h，12h，24h，结果显示：虫草多糖预保护12h作用最佳。采用western blot和RT-PCR分别在蛋白质、RNA水平上检测虫草多糖对PDGF-BB诱导细胞转型的标志物（α-SMA），MMPs，以及肾小球细胞膜上受体的变化（PDGFβR，TGF-β受体Ⅰ，TGF-β受体Ⅱ），进而继续考察受体下游信号通路（PDGF-BB/ERK，TGF-β1/SMAD）中关键因子的影响，最后PDGFβR作为虫草多糖发挥效应的关键靶点，采用荧光素酶启动子构建PDGFRβ-启动子载体，转染HMC，检测虫草多糖对PDGF-BB诱导其启动子的调控。另外，通过设计干扰RNA沉默PDGFβR的mRNA，采用western blot和RT-PCR分别在蛋白质、RNA水平上检测虫草多糖对PDGF-BB诱导的PDGFβR，TGF-β1以及PDGFβR，ERK，p-ERK， α-SMA的表达量变化。结果显示：各浓度虫草多糖均有抑制由PDGF-BB诱导的HMC细胞转型的作用，且呈剂量依赖性。虫草多糖作为多靶点药物，不仅是TGF-β1的抑制剂，维持细胞处于正常状态且通过PDGF/ERK以及TGFβ/SMAD信号通路。构建启动子荧光素酶实验确认虫草多糖是通过干预PDGFβ受体启动子活性抑制肾损伤，干扰RNA实验结果显示：PDGF受体β被成功干扰后，虫草多糖不能调回其表达量，而对TGFβ1具有调回正常水平作用。和普通小分子TGFβ1抑制剂不同，具有双向调节功能保护，使肾脏功能维持在正常水平，纠正紊乱。