洋葱雄性不育位点完全连锁基因AcSKP1的功能及互作蛋白的挖掘

SKP1 is a small protein that, as a core component of the Skp1-Cullin-F-box-protein (SCF) E3 ubiquitin ligases that mediate protein degradation by the 26S proteasome pathway, plays key roles in cell-cycle progression, transcriptional regulation, flower formation, signal transduction, and many other cellular processes in eukaryotes. AcSKP1 gene co-segregated with Ms locus (male-sterility locus) was found in our previous researches. The present study shows that there are a number of transcripts between fertile and sterile onion. Although the numerous SKP1 genes were found in plants, the phenomenon of alternative splicing about SKP1 gene was rarely reported. Whether the alternative splicing of AcSKP1 gene is also in the SCF complex formation and the biological function from the different transcriptions require further exploration. The main contents of this research: 1) the deeply mining of AcSKP1 gene transcripts; 2) transcriptional analysis of AcSKP1 gene promoter; 3) the temporal and spatial expression of specific transcripts in three lines; 4) subcellular localization of specific transcripts protein of AcSKP1 gene; 5) the function research of reverse genetics about specific transcripts of AcSKP1 gene; 6) the mining of interaction protein with specific transcripts and protein interaction. The researches are great application value in the development of a new male sterile line and utilization of heterosis, but also important theoretical significance in the molecular mechanism of onion pollen development and interaction of nuclear and cytoplasm from male sterility and fertility restoration.

S期激酶蛋白SKP1是普遍存在于真核生物中的一类小分子量蛋白质，主要参与了SCF复合体的形成，参与了包括植物花粉发育的多个生物过程。前期研究发现，洋葱雄性不育Ms座位存在一个共分离基因AcSKP1，目前研究表明该基因在可育和不育洋葱中有多个转录本。虽然植物中发现了众多的SKP1基因，然SKP1基因的可变剪接却鲜见报道，AcSKP1基因可变剪接是否也参与了SCF复合体的形成，以及不同转录本的生物学功能都需要进一步的探索。本申请项目重点开展AcSKP1基因多个转录本的挖掘、启动子功能、差异转录本在三系中的时空表达、差异转录本的定位、差异转录本与育性性状的转基因功能验证以及差异转录本互作蛋白的挖掘与互作。该项研究，不仅对洋葱新型雄性不育系的研制与杂种优势利用具有重要应用价值，而且为研究洋葱花粉发育的分子机制，揭示细胞质雄性不育与育性恢复的核质互作分子机制都具有重要的理论意义。

SKP1是普遍存在于真核生物中的一类小分子量蛋白质，主要参与了SCF复合体的形成。前期研究发现洋葱雄性不育Ms座位存在一个共分离基因AcSKP1。本研究工作主要内容包含以下5个方面：（1）转录本的挖掘与表达；（2）启动子功能分析；（3）亚细胞定位；（4）差异转录本互作蛋白的深度挖掘；（5）差异转录本与育性性状的转基因功能验证。.本研究工作的主要进展和所取得的研究成果包含5个方面：（1）明确了AcSKP1基因转录本的可变剪切与表达特性，洋葱AcSKP1基因存在强烈的可变剪切现象，在可育材料中发现了10个转录本，在不育洋葱中发现了4种转录本。其表达均为在花发育的幼蕾期高水平表达，中蕾和大蕾期无表达。（2）阐明了Acskp1基因启动子转录特性，洋葱两种类型的Acskp1启动子在转基因拟南芥中的表达未发现明显的差异现象，具有共同的转录特征，苗期在幼嫩的苗端和下胚轴基部表达，根中不表达；花期在花萼、花瓣、维管束、柱头顶端、幼嫩果荚的基部和顶部表达；而在花药中的表达具有发育阶段特性。（3）确定了Acskp1基因的亚细胞作用部位，Acskp1蛋白主要定位于细胞核、细胞质和质膜。（4）挖掘了与Acskp1互作的蛋白，成功构建了洋葱花蕾酵母cDNA混合文库。获得了与洋葱Acskp1蛋白互作的25个蛋白，发现了已报道的F-box P05和泛素蛋白P09。一个更重要的发现是获得了Myb26转录因子蛋白P14，该基因在拟南芥中影响花药的正常开裂。（5）初步验证了Acskp1基因与育性性状的关系，转ask1i基因系与野生型相比植株生长弱，突变体的花表现为瘦长，花萼短小，柱头长，花药少粉或无粉，有活力的花粉粒极少，花药壁极厚散粉困难。Acskp1基因导入突变体中，共整合载体显示Acskp1基因不能恢复突变体的育性，而有性杂交方案能够使突变体营养生长正常。.Acskp1互作蛋白连接了拟南芥三大雄性不育途径，推测Acskp1基因很可能是洋葱育性发育途径上的一个受激素调控的关键基因。其雄性不育的机理可能是orf725竞争CoxI导致电子传递链偶联低效，能量代谢不足。其恢复机制为正常的转录因子如Myb调控Acskp1表达，进而与互作的叶绿体和线粒体产生足够的能量，抵消orf725造成的能量损失，导致育性恢复。