大豆抗病响应基因GmDRR的抗病机制与互作蛋白挖掘研究

Phytophthora sojae is an destructive disease of soybeans in China and abroad. During the experiment in the last National Natural Science Foundation, a new soybean disease resistance response protein, GmDRR was isolated. To focus on this gene, the research objectives include: First, on the sequence structure, different resistant and susceptible varieties were used to amplify GmDRR gene and sequence for detecting the structure variation. Second, on the gene expression, prokaryotic expression and Real-Time PCR technology were accepted to study gene expression characteristics in different periods and tissues. Third, on the interactive network, yeast two-hybrid system was exerted to pray the interaction genes with GmDRR as a bait, and then pull down, CO-IP, and Bi-FC continue to validate the interaction in vitro and in vivo. Finally, on the gene function, by using VIGS and amiRNA technology to knock down GmDRR gene and by agrobacterium-mediated transfer to introduce the GmDRR gene into soybean susceptible cultivar and Arabidopsis, gene function was clarified. During this study, we hope to obtain the structural information and the interaction genes of GmDRR genes, construct the disease resistance network, get GmDRR transgenic plants, and further elucidate the mechanism of disease resistance and breeding varieties with resistance.

大豆疫霉根腐病是国内外大豆的重要病害。本研究利用上个国家基金执行中，课题组分离出来的大豆抗病响应蛋白GmDRR基因为研究目标，研究内容包括：第一，在序列结构抗性机制上，利用不同抗感品种获得GmDRR基因的序列变异，及序列结构与抗性的关系。第二，在基因表达抗性机制上，利用原核表达和Real-Time PCR技术研究基因在不同时期和不同组织的表达特性。第三，在网络互作抗性机制上，利用酵母双杂交系统分离与GmDRR基因存在互作的基因，并利用pull down、CO-IP及Bi-FC完成体外和体内的互作验证。最后，在基因功能抗性机制上，利用VIGS和amiRNA技术反向验证基因作用；利用农杆菌介导法转移到大豆感病品种和拟南芥中，鉴定后代抗性，验证基因功能。本研究预期可以获得GmDRR基因的结构信息，分离得到其互作基因，初步明确抗病网络，获得GmDRR转基因植株，为进一步阐明抗病机制和抗病育种服务。

大豆疫霉根腐病是一种对大豆生产严重危害的病害。本项目通过Y2H筛选，获得了与GmDRR互作的基因GmDIP1。GmDIP1可能是大豆的一类钙调蛋白，其参与Ca2+信号的调控。利用拟南芥原生质体对GmDRR与GmDIP1进行了亚细胞定位。对GmDRR与GmDIP1的蛋白进行了原核表达。通过双分子荧光互补技术、Pull-Down、免疫共沉淀、共定位技术，进一步验证GmDIP1与GmDRR基因互作关系。通过构建GmDRR-OX植物过表达载体和GmDRR-RNAi植物沉默表达载体，利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法在天隆一号品种中进行了遗传转化，获得了大豆转基因植株，并对GmDRR对大豆疫霉根腐病的响应机制进行了探索。主要结果如下：.（1）通过相关网站的预测，结果支持GmDRR与GmDIP1蛋白均为疏水性蛋白。.（2）利用拟南芥原生质体对GmDRR与GmDIP1进行定位。在拟南芥原生质体中GmDRR-GFP主要在细胞质和细胞膜中有荧光信号，GmDIP1-GFP在线粒体的组织中有荧光信号。在烟草中和大豆的愈伤组织中对GmDRR的亚细胞定位进行了进一步验证。结果显示在烟草中GmDRR主要在细胞膜上有荧光信号，在大豆的愈伤组织中主要在细胞质和细胞膜上。.（3）经原核表达实验证实在目标蛋白的位置GmDRR与GmDIP1能够大量表达，经过western-blot的检测，在目标位置成功检测到His标签。获得了具有表达功能和生物学活性的大豆GmDRR蛋白和GmDIP1蛋白。.（4）将GmDRR构建入含有cYFPn标签的植物表达载体中，GmDIP1构建入含有cYFPc标签的植物表达载体中，在拟南芥原生质体内没能看到黄色荧光信号。Pull-down结果不支持GmDRR与GmDIP存在直接互作。将GmDRR构建到含有GFP标签的植物表达载体中，将GmDIP1构建到含有Myc标签的植物表达载体中，对二者进行烟草的共注射，没能检测到二者直接互作的结果。将GmDRR构建入含有GFP标签的植物表达载体中，将GmDIP1构建入含有mRFP标签的植物表达载体中，共定位结果显示基因改变了定位，推测两个基因之间是存在一定关系的，且可能需要一定的外界条件来诱发。.（5）以天隆一号为材料对GmDRR-OX和 GmDRR-RNAi进行遗传转化，获得了T0代阳性植物GmDRR-OX 6棵，GmDRR-RNAi 11棵。