补肾健脾方药调节GR基因表达以优化衰老骨骼肌微环境的表观遗传机制研究

Studies have shown glucocorticoid receptor gene (GR) overexpression was one of the key factor of Sarcopenia, causing skeletal muscle microenvironment disorder, satellite cell dysfunction. Epigenetics modification (DNA methylation, histone methylation/ acetylation ) regulated GR expression at the transcriptional level. Our previous work indicated that the kidney-tonifying and spleen-enforcing (BSJP) recipe could regulate the DNA methylation in aged rat , down-regulate the GR gene , improve skeletal muscle mass and satellite cell function, suggesting that recipe can regulate the GR gene in skeletal muscle through epigenetic modification, but the specific mechanism was still unknown. In this research, first, a method combing stable fusion tag and high resolution MS will be used to detect DNA methylation, histone code (methylation / acetylation) level of GR gene in aging skeletal muscle, analyse the abnormal modification sites and modified abundance difference , describe the epigenetics model atlas in the aged skeletal muscle, seek the abnormal changed key factors. Next, we construct lentiviral vector , further analysis the regulation effects of overexpressing or silencing those key factors on GR gene expression with Chip-assay，CoIP technology. The work focus on clarifying the epigenetics mechanism of BSJP recipe in optimizating skeletal muscle microenvironment, slowing down skeletal muscle aging , thereby developing the new drugs.

新近研究表明：糖皮质激素受体（GR）基因的过度表达介导骨骼肌微环境紊乱，诱发相关老年病；表观遗传（DNA甲基化、组蛋白甲基/乙酰化）修饰在转录水平上调控GR表达。前期工作发现补肾健脾方药能调节老年大鼠DNA甲基化水平，且改善骨骼肌微环境，提示调节GR表观遗传修饰是方药延缓骨骼肌衰老的重要机制。但骨骼肌衰老中GR的表观遗传模式，及方药调节的具体环节尚不明了。本研究首先联合质谱/色谱、蛋白融合标签、生物信息学技术分析老年大鼠骨骼肌GR基因的异常表观遗传修饰位点及修饰丰度差异，探寻异常变化的关键修饰因子，探析方药的作用环节。接着构建慢病毒载体，应用荧光素酶双报告基因系统、Chip-assay、CoIP在卫星细胞上解析这些关键因子过表达或沉默调控GR表达的机制，及关联性。旨在探明补肾健脾方药纠正衰老骨骼肌GR基因表观遗传修饰异常水平的分子机制，为开发优化骨骼肌微环境、防治骨骼肌衰老的新药奠定基础。

随增龄，神经-内分泌-免疫网络稳态失衡。中医学认为精气盛衰是影响衰老的关键。中西医对衰老的认识有相同之处。.本研究建立自然衰老大鼠模型，结果显示：老年大鼠发生明显的骨骼肌萎缩现象。老年大鼠骨骼肌萎缩可能与HPA轴的调控异常有关。应用RU-486（糖皮质激素受体拮抗剂）能改善骨骼肌萎缩，应用地塞米松（糖皮质激素受体激活剂）则加速骨骼肌MyHC蛋白降解，发生与衰老相似的骨骼肌萎缩现象，相关信号通路因子（MuRF-1、GR、Foxo1、MyHC、MyoD等）表达异常， DNMTs、HAT，Sirt活性改变，提示GC通过表观遗传修饰进而调节下游基因的表达，促进骨骼肌萎缩。研究发现中药干预后，gr启动子17外显子的CpG位点甲基化水平有所升高，并进一步应用RNA-seq筛选差异表达基因，对蛋白质进行3D Label free乙酰化修饰定量组学分析，初步聚焦于线粒体氧化磷酸化、蛋白质代谢、脂质代谢等信号通路。.健脾方、补肾方、以及补肾健脾合方能不同程度地下调血GC、ACTH水平。其中补肾健脾合方在多个靶点发挥防治骨骼肌萎缩的效应，优于单纯健脾或补肾方药。补肾健脾方能通过改善中枢神经系统的超微结构，调节HPA/HPG轴的反馈环路，纠正GR表观遗传修饰异常，抑制炎症反应，改善蛋白合成/降解代谢，重建骨骼肌微环境稳态，防治骨骼肌萎缩，同时发现表观遗传修饰的调控是中药防治骨骼肌萎缩的重要靶点之一。进一步在细胞水平上验证了合方的有效中药单体成分淫羊藿苷，漆黄素能保护地塞米松诱导萎缩细胞模型，下调自噬通路相关因子表达，改善骨骼肌超微结构。.本研究在整体水平上，初步探明骨骼肌组织中GR基因表观遗传修饰水平增龄性变化的模式，探析中药纠正GR表观遗传修饰异常，优化骨骼肌微环境的具体环节，在细胞水平上探析中药有效成分保护骨骼肌细胞功能的效应及机制。中药能在整体水平上改善机体衰老进程，研究成果初步凝练关键药物，具有较重要的社会意义和研究推广价值。以此为基础，我们进一步将研究拓展至卵巢早衰、脂质代谢、炎性衰老等相关领域，为后续研究奠定基础。