新型双特异性Trop2/PD-L1-CAR-T细胞靶向胃癌细胞杀伤效应及分子机制

Generally speaking, chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) immunotherapy has gained increasing popularity around the world for its great potency in the treatment of hematological malignancies. Because of lack tumor specificity antigen and immunosuppressive microenvironment, CAR-T therapy have not achieved satisfactory affects for solid tumor. Our previous study indicated that Trop2 and PD-L1 is over-expressed in gastric cancer and PD-L1 is also a negative regulatory signal. We already constructed 3rd Trop2-CAR-T cells successfully. Based on the data, we will using IL-12, PD-L1 and bispecific antibody technique and develop novel bispecific CAR-T cells towards PD-L1 and Trop2, observe the cytoxicity effect for target cells in vivo and in vitro, analysis the change of microenvironment, and discuss the mechanism of the effect. In summary, the develop of the novel bispecific CAR-T cells which have never been reported before, will have important value in T cell immune therapy against solid tumor for both theoretical and clinical application.

近年来，肿瘤的免疫治疗已经引起学界的热切关注，特别是嵌合抗原受体T细胞免疫治疗在血液系统肿瘤的治疗中取得令人振奋的疗效，但在实体瘤的治疗中，由于缺乏肿瘤特异性抗原以及实体瘤微环境中免疫抑制信号的存在，导致CAR-T细胞的抗肿瘤效应降低。前期研究我们发现Trop2和PD-L1为胃癌高表达分子标志物，PD-L1同时还是负性调节信号；并已成功制备出3代Trop2-CAR-T细胞，对胃癌细胞有一定的杀伤作用。本课题拟在已有的基础上，结合IL-12，PD-L1和双特异性抗体技术，研制新型双特异性Trop2/PD-L1-CAR-T细胞，体外及体内实验观察对胃癌细胞的杀伤作用，分析微环境的变化情况，并探讨作用机制。本研究制备的新型双特异性CAR-T细胞在国内外还未见研究报道，对实体瘤的免疫细胞治疗具有重要的理论指导和临床应用价值。

CAR-T细胞治疗技术是近几年细胞免疫治疗的研究热点，而选择合适的靶分子及避免负性调节信号是制备高效、安全性好的CAR-T细胞的关键步骤。虽然CD19-CAR-T细胞治疗急性白血病已取得重大突破，但CAR-T细胞对实体瘤的治疗仍存在很多问题，从而导致疗效不佳。CAR-T嵌合的理想目标抗原是仅在肿瘤细胞高表达，而在正常组织中不表达。CAR-T细胞利用靶向抗原的单链抗体分子能特异性识别肿瘤细胞，进而通过免疫共刺激信号分子刺激，特异性地杀伤肿瘤细胞，并避免杀伤正常组织，减少毒副作用。一个单链抗体的CAR-T细胞仍然存在on-target/off tumor toxicity的风险，双特异性单链抗体则可大大降低这种风险。另外，抗原特异性T细胞在患者体内会受到负性调节因子的调控，使其抗肿瘤效应丧失或被削弱。本项目将CAR-T细胞技术和双特异性单链抗体技术相结合，制备新型双特异性Trop2/PD-L1-CAR-T细胞，一方面可双靶点、精确地识别肿瘤细胞，另一方面又可抑制肿瘤微环境中PD-1与PD-L1的结合，阻断PD-1/PD-L1负调控信号通路，可明显增强CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的作用，从而有望降低off-target toxicity的可能性，提高对胃癌的治疗效果。.本研究通过慢病毒感染开发了具有双特异性的Trop2/PD-L1特异性的第三代CAR-T细胞。CCK-8实验证实了CAR-T双特异性细胞对胃癌细胞系中表达的Trop2+和PD-L1+的特异性杀伤能力。Trop2/PD-L1 CAR-T细胞的杀伤能力高于单一CAR-T细胞(Trop2 CAR-T和PD-L1 CAR-T)和独立对照组(cd19 CAR-T和CIK)。ELISA法检测双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细胞产生IFN-γ和IL-2，以响应胃癌细胞中Trop2和PD-L1的过表达。双特异性Trop2/PD-L1CAR-T细胞释放的细胞因子(IFN-γ和IL-2)水平在所有其他类型的CAR-T细胞和独立对照组中最高。为了进一步证明双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细胞在体内的能力，本研究通过人胃癌异种移植模型验证了几种类型的CAR-T细胞的抗肿瘤作用。结果表明，双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细胞通过瘤内注射可显著抑制肿瘤生长，其抑制效果高于Trop2特异性CAR-T细胞和独立对