DDR2互作蛋白vimentin介导RA滑膜侵袭的分子机制研究

Rheumatoid arthritis (RA) seriously threatens the public health as an autoimmune disease. From inflammatory factors stimulating, the over- proliferation of synovium and the over-secretion of MMPs are the main reason of the disability of cartilage in RA. We found: ① Discoidin domain receptor 2 (DDR2) were highly expressed in RA synovium and in FLS cells;② activation of DDR2 by collagen induced the secretion of MMPs which could destroy the articular cartilage; ③ In order to elucidate the pathway from DDR2 to MMPs, the immunoprecipitation and 2D gel electrophoresis technology were used to screen the DDR2 interaction proteins. Serveral proteins were gained, one of them is vimentin；④ Markedly higher phosphorylation of vimentin in RA synovium than in normal. But the function of vimentin in the DDR2-mediated pathway is not clear. The aims of our study are (ⅰ) to observe the effects of the activation of DDR2 on vimentin;(ⅱ) to clarify how does vimentin regulate the over-secretion of MMPs, (ⅲ) to know the function of vimentin in the DDR2-mediated pathway to RA FLS cell proliferation, invasion and destruction of articular cartilage in vitro and in vivo way. All of this is to provide the new line of thinking for the treatment of RA.

类风湿性关节炎（RA）作为自身免疫性疾病，严重威胁公众健康。在其病程进展中多种炎性因子刺激引起关节滑膜异常增生并分泌具有持续性骨、软骨破坏能力的蛋白酶是RA晚期致残的主要原因。我们前期发现①酪氨酸蛋白激酶受体DDR2在RA滑膜组织和离体原代细胞中高表达；②DDR2可被胶原激活进而介导基质金属蛋白酶（MMPs）大量分泌，破坏关节软骨。③为明确DDR2活化后促进MMPs过分泌的具体机制，我们通过免疫沉淀结合2D电泳技术筛选到活化的DDR2的互作蛋白Vimentin。④RA滑膜组织中viemntin磷酸化水平显著高于正常对照。为深入研究vimentin在DDR2→MMPs通路中的作用，我们拟在前期研究的基础上，通过体外和体内实验观察DDR2活化对vimentin的影响，进而明确vimentin如何调节MMPs的过分泌及其介导RAFLS细胞增殖、侵袭和破坏关节软骨的机制，为RA的防治提供新思路。

类风湿关节炎的关节损伤与滑膜细胞“类肿瘤样”恶性增殖和MMPs的过度分泌关系密切。我们前期发现II型胶原-DDR2-MMP-1/MMP-13-II型胶原环路在介导RA关节软骨破坏中发挥重要作用。但分子机制不清。为此，我们通过免疫亲和沉淀结合SDS-PAGE电泳技术筛选分离RA FLS细胞中DDR2的相互作用分子波形蛋白（vimentin）。目前已基本完成项目申请书中的内容，获得了下列结果：1.在HK2细胞中通过免疫共沉淀的方法确认了DDR2和vimentin的相互结合关系。2. 激光共聚焦实验在RA FLS细胞中明确了DDR2与vimentin存在共定位关系。3. Western-blot提示 RA滑膜组织中vimentin的表达水平和酪氨酸磷酸化水平均高于OA滑膜组织。4. 免疫沉淀后磷酸化水平检测显示，在RA FLS细胞中，胶原活化DDR2后，能够促进vimentin酪氨酸残基的磷酸化修饰。5. qPCR实验显示vimentin的磷酸化修饰能够促进MMP9的转录，结果得到了Western-blot和明胶酶谱实验的确认。6. 双荧光素酶报告基因检测显示vimentin的磷酸化修饰能够显著提高MMP9启动子转录活性。7. 动物实验显示，vimentin干涉病毒局部下调CIA大鼠膝关节和踝关节滑膜中的vimentin后，能够显著缓解关节损伤。上述结果提示vimentin在介导DDR2过分泌MMP9及促进RA FLS细胞侵袭和软骨破坏过程中发挥重要作用。此外，为了全面了解DDR2-MMPs通路的其他调控机制，通过基因芯片，我们筛选到了介导DDR2过分泌MMP1的另一关键分子CYR61。该分子能够显著提高RA FLSs的侵袭和迁移能力，与此同时，对包括IL和TNF在内的多种炎性分子的分泌都有促进作用。下调CYR61对CIA大鼠的滑膜增殖、淋巴细胞浸润和骨破坏都有显著改善作用。本课题完善和补充了DDR2-MMPs通路中关键环节和关键分子，为阐明RA中晚期病变的发病机制及新的药物靶点的开发提供了新思路。以上研究内容严格按照申请书执行。本课题在实施期间培养在职研究生1名，发表学术论文6篇，其中SCI收录2篇，中文核心文章2篇，省级期刊文章2篇，另有1篇SCI文章处于审稿阶段。