Wnt途径Ⅰ类拮抗物基因甲基化调控机制与结直肠肿瘤治疗的研究

结直肠癌是严重威胁人类健康的高发肿瘤之一。90%的结直肠癌中存在Wnt途径的异常激活，我们的前期研究显示：Wnt途径细胞外拮抗物基因甲基化失活以高频率出现在结直肠肿瘤早期，可能成为结直肠肿瘤早期诊断的分子标志物；DNMT和HDAC是参与表基因调控的关键酶，研究表明DNMT和HDAC可能是通过"载体"与基因启动子结合，抑制基因转录，抑制这些"载体"蛋白可以阻断基因启动子甲基化，恢复基因功能，而不会影响DNMT其它重要的生理功能；本研究用基因芯片、染色质免疫沉淀和RNA干扰技术筛选在结直肠肿瘤中介导Wnt途径胞外拮抗物基因启动子与DNMT及HDAC发生反应的"载体"蛋白，作为去甲基化治疗的新靶点，在结直肠肿瘤的早期发现并阻断肿瘤的发展，利用表基因改变的可逆性达到防治肿瘤的目的。

结直肠癌是严重威胁人类健康的高发肿瘤之一。90%的结直肠癌中存在Wnt途径的异常激活，Wnt途径细胞外拮抗物基因甲基化失活以高频率出现在结直肠肿瘤早期，可能成为结直肠肿瘤早期诊断的分子标志物；其基因家族的启动子区CpG岛甲基化失活作为结直肠肿瘤的发病机制已经得到广泛共识。DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, DNMT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deactylases, HDAC）是参与表基因甲基化模式调控的关键酶，研究表明DNMT和HDAC可能是通过“载体”与基因启动子结合，抑制基因转录，抑制这些“载体”蛋白可以阻断基因启动子甲基化，恢复基因功能，而不会影响DNMT其它重要的生理功能；.本课题分两部分完成，通过第一阶段的研究，联合四种粪便Wnt拮抗基因甲基化对结直肠癌和腺瘤的检测率分别为81.3% (39/48)和65.7% (23/35), 同时进展期腺瘤的阳性检测率（80.0%）明显高于非进展期（55%）, 而非进展期腺瘤和增生性息肉间无统计学差异。联合检测Dukes A期CRC和进展期腺瘤的敏感性高达81.8%(18/22), 特异性为93.3%(28/30)。SFRPs和WIF-1基因甲基化与大肠癌的临床病理特征无相关性(均P>0.05)。对于Ducks A大肠癌和进展期腺瘤的检测阳性率, 组合四种Wnt拮抗基因甲基化（81.8%）明显优于粪便潜血试验（31.8%）, 两者差异有统计学意义(P <0.001)。.第二阶段通过对人胚胎正常肠粘膜细胞株CCC-HIE-2，人结肠腺癌癌细胞株SW1116、SW480、HCT116的SFRP1、SFRP2及WIF1基因启动子区CpG岛的甲基特异性PCR（methylation-specific PCR, MSP）测定，结合生物信息学核心启动子区转录因子结合位点数据分析，提示肿瘤中甲基化模式改变并非依赖于DNMT表达异常，DNMT位置的重新分布是其重要机制。结合实时荧光定量PCR(real-time qPCR,RT-qPCR)及人全基因组表达谱芯片结果，进一步印证肿瘤组织中并不一定存在DNMT表达上调，同时以BMI1、EZH2及MBD2为靶蛋白进行的ChIP，证实了靶蛋白定位于SFRP1、SFRP2、WIF1基因启动子区，招募DNMT，参与结直肠肿瘤中sFRP基因启动子甲基化。