利用单细胞测序技术研究脂肪间充质干细胞向血管平滑肌细胞定向分化的机制

Transplantation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is a promising cellular therapy to promote angiogenesis and wound healing. However, the insufficiency of VSMCs greatly limits their therapeutic application in vascular disease. Despite progress in understanding the mechanisms of VSMC differentiation, there remains a shortage of robust methods for generating lineage-specific VSMCs from pluripotent and adult stem/progenitor cells in serum-free conditions. Recently, using single cell sequencing to study the heterogeneity of ADSCs, we found that there existed a group of VSMCs oriented precursor cells in adipose derived mesenchymal stem cells (ADSCs). Furthermore, several clues suggest that the purification of these cells may significantly increase the differentiation efficiency of ADSCs into lineage-specific VSMCs. In this study, we devote to establish a standardized induction process for ADSCs - VSMC precursor cell subsets purification - VSMC directional differentiation, and expound the molecular regulatory mechanism underlying S protein-related directional differentiation of VSMC by the integrated application of single cell sequencing, bioinformatics analysis, cell separation and purification, and directional differentiation of stem cells. This work will not only enable us to provide sufficient functional VSMC–like cells for cell therapy of vascular disease, but also shed lights in understanding the molecular mechanisms of VSMC precursor cell directional differentiation.

血管平滑肌细胞(VSMCs)移植是促进血管新生和创伤愈合的一种有效的细胞治疗方法。然而VSMCs的来源不足严重局限了其在血管疾病治疗中的研究和应用。尽管目前人们对VSMCs分化机制的认识有所进展，但仍缺乏稳定高效的从多能干细胞中获得谱系特异性VSMCs的方法。我们在前期利用单细胞测序研究人脂肪间充质干细胞（ADSCs）的异质性时发现，ADSCs中存在VSMCs定向前体细胞的群体，且其表面存在与分化相关的细胞表面标记—S蛋白。同时，多个线索提示，将此群细胞纯化会显著提高ADSCs向VSMCs的分化效率。本课题将综合利用单细胞测序技术，生物信息学分析技术，细胞分选纯化技术，以及干细胞定向分化诱导技术，建立一种ADSCs—VSMC前体细胞亚群纯化—VSMC定向分化的标准化诱导流程，并阐述S蛋白在VSMC定向分化中的分子调控机制；为血管疾病的细胞治疗提供大量有功能的成熟VSMC细胞。

血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells, VSMCs）移植是促进血管新生和创伤愈合的一种有效的细胞治疗方法，然而VSMCs的来源不足严重局限了其在血管疾病治疗中的研究和应用。尽管目前人们对VSMCs分化机制的认识有所进展，但仍缺乏稳定高效的从多能干细胞中获得谱系特异性VSMCs的方法。脂肪来源的间充质干细胞(Adipose-derived Stem Cells, ADSCs）因其方便获取，可用于干细胞治疗。淋巴水肿是由于淋巴系统的内在缺陷或外在损伤导致淋巴液回流受阻而产生的慢性组织水肿，分为原发性淋巴水肿和继发性淋巴水肿两大类，其中继发性淋巴水肿常发生在恶性肿瘤局部淋巴结清扫/切除治疗后，表现为患肢肿胀、过度纤维化增生、异常脂肪沉积和皮肤病变。淋巴水肿这类并发症的发生严重影响了患者的生活质量。目前对淋巴水肿发病机制的研究尚不完整，仍缺乏有效的治疗方法。本课题综合利用单细胞测序技术、生物信息学分析技术、细胞分选纯化技术以及干细胞诱导分化等多重技术手段，建立标准化 ADSCs—VSMC 前体细胞亚群纯化—VSMC 定向分化诱导体系，并探索在此过程中其关键作用的信号分子及其调控机制，为血管疾病的细胞治疗提供大量有功能的成熟VSMC细胞。同时基于对ADSCs的研究经验，建立淋巴水肿疾病模型下脂肪组织的血管基质组分(Stromal Vascular Fraction, SVF)的单细胞转录组图谱。该项目执行期间，完成了体外分离培养ADSCs及相关检测鉴定的研究，并对分离的ADSCs进行了成骨、成脂和成软骨诱导分化，证明其具有多向分化潜能；对ADSCs分泌外泌体中miRNA对血管生成产生的影响进行了验证；完成了对ADSCs的单细胞测序，研究ADSCs的异质性，探究重要基因在细胞分化方向中的决定作用；完成了ADSCs向VSMC定向诱导分化方案的筛选；完成了对脂肪样本中SVF进行单细胞测序分析，探究淋巴水肿疾病模型下SVF的异质性，ADSCs与巨噬细胞中不同亚群的基因表达谱和特异性调节因子，并验证ADSCs表达的基因CLEC3B可作为治疗淋巴水肿纤维化的基因靶点以及LR12可作为治疗淋巴水肿的有前景的药物。