miR-133b突变体与绵羊骨骼肌双肌表型关联分析及其在肌肉发育中的功能初探

miRNA作为一种重要的基因转录后水平发生调控作用的因子，在动物肌肉的发生与发育中起着至关重要的作用。最新研究表明miRNA前体的突变使得生成成熟体的量发生改变。基于此，本项目以双肌表型的肉羊和普通对照羊为研究对象，以课题组新近发现的两处miR-133b前体SNPs为核心议题，探索突变型前体与绵羊双肌表型的关联性及其在肌肉发育中的初步功能。为此，本研究采用基因分型技术检测大群体肉羊与对照羊骨骼肌miRNA的多态性，重点分析miR-133b多态与双肌表型的关联性；同时构建miR-133b突变型与野生型前体的体外表达载体、转染Hela细胞并检测两者生成成熟miR-133b的能力差异；验证1～2个与miR-133b存在靶标关系的功能基因，并证明两者互作的调控关系在在肌肉发育中的初步功能。本研究所获得的miRNA分子标记将直接用于肉羊品种选育，并为揭秘双肌表型的miRNA分子机制提供科学依据。

miRNA作为一种重要的基因转录后水平发生调控作用的因子，在动物肌肉的发生与发育中起着至关重要的作用。最新研究表明 miRNA前体的突变使得生成成熟体的量发生改变。为了掌握绵羊骨骼肌中miRNA的表达情况，深入探索其在绵羊骨骼肌发育过程中的表达特点及靶向调控的基因，进一步阐明miRNA对绵羊骨骼肌发育的调控机制，为优质肉羊品种的培育提供理论基础及新的育种手段。本研究采用PCR-SSCP的方法对骨骼肌中高表达miRNA前体序列在4个不同产肉性能绵羊品种中的突变进行检测，寻找在不同产肉性能绵羊品种间差异较大的突变，分析相关突变与绵羊产肉性能之间的关系。使用qRT-PCR技术检测绵羊骨骼肌中高表达miRNA在绵羊胚胎期第40 d、60 d、80 d、100 d、120 d以及初生、6月龄和周岁绵羊骨骼肌组织中的表达变化，并分析其与绵羊骨骼肌发育之间的关系。构建绵羊胚胎期第60 d和成年羊骨骼肌中高表达miRNA的靶基因文库，并以绵羊骨骼肌卫星细胞为材料，采用qRT-PCR和Western Blot技术研究miR-133过表达和抑制表达对绵羊骨骼肌卫星细胞生长以及miR-133的4个候选靶基因表达的影响，分析miR-133对绵羊骨骼肌细胞生长的调控作用。我们发现绵羊骨骼肌中22个高表达的miRNA前体序列在4个产肉性能不同的绵羊品种中的突变情况进行了研究，首次在16个miRNA前体序列中检测到共计49个突变，其中包括41个单碱基突变和8个插入/缺失突变，另有6个miRNA前体序列没有检测到突变；对其中的3个突变在5个产肉性能不同的绵羊品种共计640份基因组样品中进行了进一步研究，发现miR-133a前体序列的CCC插入/缺失突变与绵羊的产肉性状高度相关；绵羊骨骼肌中22个高表达miRNA在绵羊骨骼肌发育的不同时期表达量会出现上调或者下调，其表达量按照4种基本的模式发生变化；成功构建了绵羊胚胎期和成年期骨骼肌高表达miRNA靶基因文库；我此外还发现miR-133在绵羊骨骼肌卫星细胞中可靶向调控Rhoa，CDC42，TAGLN2基因的表达，造成其蛋白表达量极显著下调。通过上述研究，对绵羊骨骼肌中miRNA的表达情况及其靶基因有了较为全面的认识，对骨骼肌不同发育阶段miRNA的表达变化情况及其功能有了更为深入的掌握。以上研究工作为进一步阐明绵羊骨骼肌发育的分子调控机制奠定基础。