转录因子LeSPL-CNR在番茄成熟转录调控网络中作用机制的研究

Tomato fruit ripening is a complex genetic trait correlating with notable fruit phenotypic, physiological and biochemical changes. It decides the postharvest qualities and storage characteristics of fruit. During ripening process, transcription factor LeSPL-CNR plays an important role; however, the exactly regulatory mechanism is not clear. Therefore, in this project, we propose to find out some important upstream regulatory factors of LeSPL-CNR gene, interaction factors and targeted genes of LeSPL-CNR protein via yeast one hybrid system, yeast two hybrid system, chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing (ChIP-seq). Furthermore, the biological functions of acquired targeted genes are identified by virus-induced gene silence (VIGS) and virus-induced gene complementation (VIGC). Finally, a local transcription regulatory network around LeSPL-CNR for tomato ripening will be made. These results will illustrate the biological significance of LeSPL-CNR protein for tomato ripening and fruit quality forming, promote the identification and deeply development of the tomato germplasm resources, and provide theoretical foundation for getting better quality, storable or specialized tomato cultivars through molecular breeding.

番茄果实成熟是涉及表观形态、生理和生化变化的复杂遗传性状，决定着果实采后的品质及贮藏特性，其中调控番茄果实成熟的重要转录因子LeSPL-CNR在该过程中起着关键调控作用，但其具体的调控机制尚不明确。因此，本研究将分别利用酵母单杂交、酵母双杂交及染色质免疫共沉淀结合深度测序（ChIP-seq）技术筛选LeSPL-CNR基因的上游调控因子、LeSPL-CNR蛋白的互作因子以及下游调控靶标，并利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）及病毒诱导的基因互补（VIGC）技术对部分关键靶标基因的生物学功能进行验证，进而构建出番茄果实成熟过程中以LeSPL-CNR为中心的局部转录调控网络。研究成果将揭示LeSPL-CNR蛋白对番茄成熟和果实品质形成的生物学意义，促进番茄种质资源的鉴定及深度开发，为通过分子遗传育种途径培育优质、耐贮或专用番茄品种提供理论基础。

番茄果实成熟是涉及表观形态、生理和生化变化的复杂遗传性状，决定着果实采后的品质及贮藏特性，其中调控番茄果实成熟的重要转录因子LeSPL-CNR在该过程中起着关键调控作用，但其具体的调控机制尚不明确。因此，本研究旨在通过生物信息学、分子生物学、生物化学、分子遗传学以及病毒介导的反向遗传学等技术手段，探讨LeSPL-CNR结构与其生物学功能之间的相互关系，加深对LeSPL-CNR参与番茄成熟调控机制的了解。研究结果表明：1）通过Potato virus X（PVX）介导的基因沉默，能够有效降低野生型番茄（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig）果实中LeSPL-CNR的表达。通过表型观察以及生理、生化指标分析，发现病毒接种果实出现了成熟延缓的现象，同时LeSPL-CNR的沉默对番茄果实中乙烯合成相关基因和成熟相关转录因子的表达有明显影响。2）利用South-Western杂交和酵母单杂交技术初步筛选出14和28个可能与LeSPL-CNR启动子上游286 bp特异片段结合的调节因子；利用酵母双杂交技术初步筛选出15个可能与LeSPL-CNR蛋白互作的调控因子。3）利用RNA-seq（RNA sequencing）检测发现Cnr突变对473个基因的表达有显著影响，同时利用iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术分别在破色期及破色后5天的Cnr突变果实中检测到1024和1018个差异表达蛋白，这些差异表达基因或蛋白主要参与到metabolism及Genetic information processing通路中；4）通过PVX诱导的CBP1（CNR binding protein 1）沉默以及CBP1沉默株系构建，发现LeSPL-CNR互作蛋白CBP1影响番茄植株及果实的发育；5）LeSPL-CNR基因中包含SlymiR157的作用位点，SlymiR157依赖于表达量的调节，通过miRNA介导的mRNA降解或翻译抑制精细调控LeSPL-CNR的表达，参与到番茄成熟调控网络之中。研究成果将有助于揭示LeSPL-CNR对番茄成熟和果实品质形成的生物学意义，促进番茄种质资源的鉴定及深度开发，为通过分子遗传育种途径培育优质、耐贮或专用番茄品种提供理论基础。