c-di-GMP信号受体与前噬菌体蛋白共调控细菌毒性表达的分子机理

Functional identification of the receptors is of scientific importance for elucidation of the c-di-GMP signaling pathway involved in regulation of virulence in pathogenic bacteria. Our previous studies identified the cyclic di-GMP receptor PXO_02374, which is a PilZ-domain containing protein and involved in negative regulation of virulence of Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) strain PXO99A. The specific interaction between PXO_02374 and PXO_03510, a putative prophage protein occurred. Single and double gene deletion of two interacting proteins resulted in increased virulence of the pathogen, indicating their negative co-regulation of Xoo virulence. These results suggest the existence of a novel c-di-GMP signal pathway in Xoo, in which PXO_02374 interacts with PXO_03510, and whereby regulates bacterial virulence expression. Here, further studies on the molecular interactions of PXO_02374-PXO_03510 and its regulatory mechanism(s) of virulence of Xoo will be proposed, including interaction modes, the relationship and regulation between PXO_03510 and PXO_02374, subcellular localization, co-regulation of downstream genes. The objectives of this study are to demonstrate the novel PilZ-type receptor-mediated c-di-GMP signaling pathway, and to reveal the negative regulatory mechanism(s) of virulence in Xoo.

c-di-GMP信号受体参与细菌毒性调控机制的研究将有助于细菌信号调控机理的解析。前期鉴定了一个对水稻白叶枯病菌毒性具有抑制功能的c-di-GMP信号受体—PilZ结构域蛋白PXO_02374，其与前噬菌体蛋白PXO_03510特异性互作，二者基因缺失突变均导致致病性增强，推测病菌可能具有一个新的c-di-GMP信号通路。本申请拟深入探究两个互作蛋白的作用方式以及对病菌毒性调控的分子机理，内容包括：(1)c-di-GMP—互作蛋白(PXO_02374和PXO_03510)的作用机制研究；(2)PXO_02374与PXO_03510的表达调控关系研究; (3)互作蛋白亚细胞定位；(3)互作蛋白对水稻白叶枯病菌毒性表达的共调控作用分析。本研究旨在鉴定和发掘PilZ受体介导的c-di-GMP信号调控新途径，揭示其负向调控Xoo毒性表达的分子机理。

前期研究发现，c-di-GMP信号受体蛋白PilZX2 (PXO_02374)可以作为c-di-GMP受体负调控水稻白叶枯病菌（Xoo）毒性表达(Yang et al., AEM, 2015)。本项目进一步解析了PilZX2通过与前噬菌体蛋白PXO_03510(ProP)及c-di-GMP信号代谢蛋白互作对Xoo毒性的调控机制，研究内容包括：1)PilZX2与ProP互作机制及运动性调控分析；2) c-di-GMP受体PilZX2与c-di-GMP信号代谢蛋白互作分析；3) PilZX2与GdpX6的互作机制研究； 4) PilZX2与GdpX6毒性调控功能分析；5) PilZX2与GdpX6亚细胞定位分析；6) c-di-GMP受体Filp及其互作蛋白PilZX3下游的共调控蛋白的鉴定；7) c-di-GMP代谢酶PdeR互作蛋白的鉴定；8) c-di-GMP代谢蛋白PXO_03945的功能鉴定与分析。取得了主要研究结果包括：1) 研究发现PilZX2与ProP负调控Xoo运动性，但是与ProP互作并不影响PilZX2与c-di-GMP的结合；2) 鉴定了PilZX2可以和17个c-di-GMP代谢蛋白发生互作，其中包括GGDEF结构域蛋白GdpX6； 3) GdpX6具有DGC活性，并且可以和c-di-GMP结合；4) 发现GdpX6负调控Xoo的毒性和鞭毛运动，正调控Xoo的菌毛运动和生物膜形成；5) PilZX2和GdpX6都是多细胞定位；6) 鉴定了Filp/PilZX3共同调控下游的共调控蛋白，包括多个受c-di-GMP信号调控的Xoo中的毒性新因子；7)反应调控蛋白TriP通过与c-di-GMP磷酸二酯酶PdeR相互作用，正调控Xoo毒性和EPS的产生；8) PXO_03945正调控 Xoo致病性、运动以及体内c-di-GMP水平，负调控 EPS和生物膜的产生；9) 综述了水稻黄单胞菌c-di-GMP信号转导的关键成分及其在黄单胞菌中的同源序列，以及c-di-GMP受体介导的细菌行为调控和病原菌中c-di-GMP受体调控机制的研究进展。本研究初步阐明了水稻白叶枯病菌中PilZX2通过与下游蛋白互作负调控Xoo毒性机制。