磷酸二酯酶PdeR调控水稻白叶枯病菌毒性的分子机制研究

Metabolism of second messenger c-di-GMP is controlled by opposing activities of diguanylate cyclase (DGC) containing the GGDEF domain and phosphodiesterase (PDE) bearing the EAL domain. We have previously identified a two-component system response regulator PdeR in the bacterial blight pathogen of rice, Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), which contains GGDEF-EAL output domains and REC input domain.We showed that PdeR had c-di-GMP specific PDE activity,and regulated the virulence of Xoo(MPMI, 2012, 25:1561-1569). This project proposes to further analyze the functional mechanism of PdeR using genetics and biochemistry approaches, which includes (1) to understand the function of each domain of PdeR in performing the PDE enzymatic activity; (2)to identify PdeR-interactors in Xoo; (3)to detect the subcellular localization of PdeR and its interactors; (4) to demonstrate the influence of PdeR on the intracellular c-di-GMP level; (5)to discover the genetic relationship between PdeR and the c-di-GMP receptor Clp. The goal is to elucidate the c-di-GMP signal metabolism pathway mediated by PdeR and the molecular mechansim of it to regulate bacterial virulence expresssion, which will provide scienfic basis for fully revealing the pathogenesis of Xoo.

细菌第二信使c-di-GMP的代谢分别受到具有GGDEF结构域的鸟苷酸环化酶(DGC)和具有EAL结构域的磷酸二脂酶(PDE)的控制。前期发现，水稻白叶枯病菌(Xoo)双组分系统应答调节蛋白PdeR含有GGDEF-EAL-REC 结构域，具有降解c-di-GMP的PDE酶活性，并且调控了Xoo的毒性(MPMI, 2012, 25:1561-1569)。本项目将使用遗传学、生物化学等手段对PdeR的作用机制进行深入研究，内容包括：(1)解析PdeR不同结构域在行使PDE酶活性中发挥的功能；(2)鉴定PdeR的互作蛋白；(3)了解PdeR及其互作蛋白的亚细胞定位情况；(4)检测PdeR对胞内c-di-GMP水平的影响；(5)明确PdeR与信号受体Clp之间的关联。旨在阐明PdeR介导的c-di-GMP信号途径及其对病菌毒性调控的分子机制, 为全面揭示Xoo的致病机理提供科学依据。

前期发现水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）双组份系统PdeK/PdeR通过c-di-GMP信号途径，调控了Xoo胞外多糖的产生和对水稻叶片的致病性。体外反应条件下，PdeR的磷酸二酯酶活性可以被PdeK激活。为了进一步解析PdeR的调控网络，本研究筛选和鉴定了Xoo中PdeR的互作蛋白。通过酵母双杂交筛选的方法，获得了互作蛋白TriP（transcriptional regulator interaction with PdeR）。通过GST pull-down试验验证了二者的互作。结构域互作的结果显示TriP的REC结构域可以结合PdeR的EAL结构域。体外磷酸二酯酶活性检测结果显示，在PdeK存在时，TriP可以增强PdeR的酶活性。相关基因突变体的表型检测结果显示，与PdeR相似，TriP正调控了Xoo的致病性和胞外多糖的产生。在triP基因突变体中表达pdeR，可以基本恢复其胞外多糖产量至野生型水平。这些结果说明TriP可能位于PdeR的上游，共同调控了Xoo胞外多糖的产生。另外，通过转录组测序的方法，发现PdeR和TriP共同调控了188个基因的表达，更进一步支持了二者在遗传途径中也存在互作。该成果增进了我们对于细菌第二信使c-di-GMP信号调控途径的认知，为将来研究两个双组份系统之间存在的调控互作奠定了基础。