基于上皮间质转化（EMT）的藤黄酸抗肿瘤侵袭转移作用机制研究

肿瘤的侵袭和转移是人类攻克癌症道路上主要障碍之一。最新研究表明，上皮间质转化（EMT）是肿瘤发生侵袭和转移的前提，EMT将成为抗肿瘤侵袭转移的重要靶标之一。前期研究工作发现，藤黄酸具有显著的抗肿瘤侵袭转移作用，并对EMT标志物N-钙粘素和E-钙粘素等有调节作用，提示藤黄酸对EMT介导的肿瘤侵袭转移具有抑制作用，但是其调控机制目前未见报道。本课题拟采用RNAi、转染、免疫沉淀、酶活检测等先进的分子生物学技术，从细胞、整体和分子水平对EMT相关的Integrin-Src-FAK、蛋白酪氨酸激酶-RAS-MAPK、Wnt及RAS-PI3K/AKT-MMP信号通路进行研究，寻找可能靶点，阐明藤黄酸在抗肿瘤侵袭转移中的作用机制，为藤黄酸的应用提供理论依据，并且为基于EMT的新型抗肿瘤侵袭和转移药物研发提供参考。

在项目研究过程中，我们建立了合理的肿瘤侵袭转移动物模型，如乳腺癌细胞MDA-MB-231的原位接种肺转移模型和A549肺癌细胞尾静脉注射肺转移模型等模拟癌症转移过程，评价藤黄酸的体内抗肿瘤转移作用。体外评价了藤黄酸对高转移肿瘤细胞B16F10和A375在粘附、迁移、侵袭及细胞外基质水解的影响，建立转化生长因子TGF-β1刺激肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)模型，利用免疫荧光，免疫印迹以及实时定量PCR实验方法研究藤黄酸对 EMT 关键表型分子(E-cadherin、N-cadherin、vimentin和MMPs等)的调节作用，从而确定藤黄酸通过抑制转录因子TWIST1蛋白水平在转录水平上调控EMT过程。前期研究结果表明藤黄酸可能作用于多条信号转导通路从而抑制肿瘤细胞侵袭转移，如 Integrin-Src-FAK、Ras-Raf-MAPK、PI3K-AKT及NF-κB通路等。由此我们利用蛋白免疫印迹实验检测相关通路的蛋白激酶的磷酸化水平，寻找出NF-κB通路是藤黄酸抑制肿瘤细胞EMT的关键信号通路，并且分别加入了NF-κB通路激活剂和其他通路的特异性抑制剂以确定NF-κB通路的重要性。藤黄酸阻断EMT过程是通过抑制IKK，IκB的磷酸化，从而抑制转录因子NF-κB p65入核与EMT相关转录因子TWIST1的启动子结合。根据藤黄酸对EMT的关键信号通路的相关基因及蛋白的调控，采用基因转染，小干扰RNA等方法找寻其可能的靶点，研究发现藤黄酸的直接配体转铁蛋白受体在藤黄酸抑制EMT过程中并未发挥关键调控作用。本研究阐明藤黄酸在抗肿瘤侵袭转移中抑制EMT的作用机制，为藤黄酸的应用提供新的理论依据，并且为基于 EMT 的新型抗肿瘤侵袭和转移药物研发提供了参考。