禽类防御素AvBD103b干扰病原菌细胞膜和核酸的关键结构研究

On the basis of our research group previous work about avian beta-defensin, more theoretical and experimental research will be conducted as follows: The method of the truncation of the secondary structur and amino acid substitution in the secondary stucture including N-terminal with α-helix propensity, β-sheet, loop structure and hydrophobic patch were used to find these structures how to interfere with the cell membrane and nucleic acids of the pathogen. The method of membrane changes observed by transmission electron microscopy, interaction with liposomes, determination of the outer membrane and the plasma membrane permeability, leakage of intracellular potassium ion experiments and bacterial cell membrane integrity analysis were used to analysis the effection of AvBD103b on bacterial cell membrane. The method of DNA gel retardation assay, scanning DNA binding by atomic force microscope, detection of DNA structural changes by circular dichroism, competitive binding fluorescence spectroscopy and specific binding to DNA analysis were used to analysis the effection of AvBD103b to bacterial DNA or RNA. The key structure interfering with the cell membrane and nucleic acids and anti-bacterial mechanism of AvBD103b will be clarified and the antimicrobial mechanism of avian β-defensin will be further improvend, which will lay a theoretical foundation for promotting the application of AvBD103b on the alternative to antibiotics。

在课题组禽类β-防御素AvBD103研究的前期工作基础上，开展如下研究：采用截短二级结构区或氨基酸替换破坏结构区的方法来研究AvBD103b的α-螺旋倾向N端、β-折叠、Loop结构及疏水斑对病原菌细胞膜和核酸的干扰作用。具体是用透射电镜观察细胞膜变化、与脂质体互作、外膜及质膜渗透性测定、胞内钾离子泄露实验和细菌细胞膜完整性分析进行AvBD103b对细菌细胞膜作用的研究；通过DNA凝胶阻滞实验、原子力显微镜扫描与DNA结合、圆二色谱检测DNA结构变化、竞争性结合荧光光谱以及与DNA特异性结合分析进行AvBD103b对细菌DNA或RNA的作用的研究，通过上述结果明确AvBD103b对细胞膜和核酸干扰的关键结构，揭示AvBD103b的抗菌机理，进一步完善禽类β-防御素的抗菌机理，为推动禽类防御素AvBD103b作为饲料添加剂在替代抗生素方面的应用奠定理论基础。

抗生素在畜牧业中过量使用导致病原菌耐药性增强，禁止其在饲料中添加已成为国际共识，因此，寻求安全、高效的新型抗菌制剂已经迫在眉睫。防御素以其独特的抑菌机制、抗菌谱广、不易产生耐药性以及来源安全等优点，有可能被开发成传统意义上的抗生素替代品。禽类防御素AvBD103b以其广谱抗菌性和在高盐和高渗透压下仍保持其杀菌效率而可能成为新型高效的抗菌制剂的候选制剂。但在其构效关系、抗菌机理和低成本制备等方面的研究目前还处于空白，这些极大限制了AvBD103b成为新型抗生素替代品在饲料上的应用。.本项目（1）根据AvBD103b的二级结构特征，采用分别截短二级结构（α-螺旋倾向N端、3个β-折叠及Loop结构）来拟定与AvBD103b与干扰细胞膜和核酸相关结构，分子设计AvBD103b衍生肽；（2）用透射电镜观察细胞膜变化、NPN吸收分析对外膜的作用及流式细胞仪分析碘化丙啶染色细菌胞膜完整性等进行AvBD103b及其衍生肽对对肠炎沙门氏菌的壁膜具有干扰作用，通过破坏膜结构，造成细胞内容物泄漏，导致细胞死亡；（3）借助凝胶阻滞、圆二色谱、原子力显微镜以及流式细胞仪等实验结果表明胞内DNA也是AvBD103b及其衍生肽的作用靶点，其能够与DNA结合并影响DNA的复制和细胞的分裂。.通过上述结果明确AvBD103b 对细胞膜和核酸干扰的关键结构，揭示AvBD103b 的抗菌机理，进一步完善禽类防御素的抗菌机理，为推动AvBD103b 作为饲料添加剂在替代抗生素方面的应用奠定理论基础。.合同书之外，针对当前AvBD103b难于天然提取和化学合成成本高的问题，本研究尝试其异源重组表达研究：（1）按照大肠杆菌密码子使用的偏爱性优化AvBD103b基因序列并分别构建了表达载体pET28a-MMIS-AvBD103b、pET32a-AvBD103b、pSUMO-AvBD103b以及pGEX-6p-1-AvBD103b，转化大肠杆菌，SDS-PAGE电泳验证了其在大肠杆菌中的融合表达，并进行了融合蛋白GST-AvBD103b和Trx-AvBD103b的纯化。（2）按照酵母菌密码子使用的偏爱性优化AvBD103b基因序列并构建了pGAP-AvBD103b和pGAP-MAvBD103b重组表达载体，转化毕赤酵母X-33，通过发酵液抑菌活性鉴定和质谱鉴定其在酵母中实现了重组表达。