海马神经干细胞/前体细胞中DNA损伤应答和let-7b-cyclin D1交互作用在电离辐射所致神经发生障碍中的作用机制

So far, the research has shown that the deficits in hippocampal neurogenesis caused by ionizing radiation is one of the main reasons at cellular level for radiation-induced cognitive impairment. But the underlying mechanisms are still unclear. The majority of the current studies have focused on radiation-induced changes in the microenvironment of hippocampal neural stem/precursor cells but not their own responses. Our previous studies have demonstrated that cranial irradiation led to cognitive impairments in rats, which was associated with the doses of radiation exposure and the capacity of DNA damage repair in hippocampal tissue. Based on our previous results, we propose to further investigate the molecular mechanisms of the deficits in hippocampal neurogenesis caused by radiation. We plan to study proliferation and differentiation in hippocampal neural stem cells after radiation both in vitro and in vivo. In vitro, we will compare the alterations in proliferation and differentiation of hippocampal neural stem cells after radiation under the conditions of inhibiting DNA damage response (DDR) with kinase inhibitors and/or let-7b and cyclin D1 regulation; In vivo, we will compare the hippocampal neurogenesis in irradiated ATM mutant mice and wild-type mice after the retrovirus expressing sh-let-7b are grafted into their dentate gyrus (DG). Thus we can test our hypothesis that the crosstalk between DDR pathways and let-7b-cyclin D1 in hippocampal neural stem/precursor cells regulates their proliferation and differentiation after radiation. The research results will advance our understanding of the underlying mechanisms of hippocampal neurogenesis deficit caused by ionizing radiation,thereby may have implications in preventing and treating radiation- induced cognitive impairment.

电离辐射造成的海马神经发生障碍是放射性认知损害的关键因素，但其分子机制尚不明确，之前的研究多着眼于电离辐射所致的神经干/前体细胞微环境改变，而忽略了神经干/前体细胞对于辐射损害的修复能力。我们前期预实验结果显示：放射性认知损害不仅具有剂量依赖，而且更与海马的DNA损伤修复能力相关。本项目拟在此基础上，通过体外干预海马神经干细胞的DNA损伤应答信号通路（DDR）和/或干预miRNAlet-7b对cyclin D1表达的调控，观察其受照射后增殖和分化的改变；体内实验通过研究ATM突变小鼠和脑内注射逆转录病毒调控miRNAlet-7b的表达，研究不同组间受照射后海马区神经发生情况的变化，以期明确海马神经干/前体细胞中DDR和let-7b-cyclin D1的交互作用对其受照射后增殖和分化具有调控作用，进而揭示电离辐射造成海马神经发生障碍的分子机制。研究结果可对放射性认知损害的防治提供一定的指引。

电离辐射造成的海马神经发生障碍是放射性认知损害的关键因素之一，但分子机制尚不明确，现有研究多着眼于电离辐射所致的神经干/前体细胞微环境改变，而忽略了神经干/前体细胞对于辐射损害的修复能力。本项目拟在原有课题的研究基础上，探讨电离辐射造成海马神经发生障碍的分子机制。首先检测神经干细胞接受电离辐射照射后其增殖、干性和分化等特性与照射剂量的关系；发现超过0.5 Gy的照射可导致神经干细胞向神经元分化的能力下降，但对向神经胶质细胞分化的能力无明显影响，这些变化伴随着神经干细胞周期阻滞和凋亡的变化。通过采用ATM抑制剂、Rad51抑制剂与DNA-Pkcs抑制剂等干预处理后，证实同源重组修复是神经干细胞修复DNA损伤最主要的方式。进一步采用转染技术发现let-7b与神经干细胞增殖密切相关，而let-7b的一个靶cyclin D1与之无明显相关性，提示cyclin D1的表达并不完全依赖于let-7b。根据上述结果，我们推导出了2种可能对于放射性认知损害防治有益的药物，并进行了相关机制探究。我们发现米诺环素对放射性认知障碍有显著的缓解作用，其可明显减轻电离辐射对神经干细胞克隆形成的抑制作用，且随着辐射剂量的提高，米诺环素的保护作用亦更明显。这些保护作用是通过细胞G2/M期阻滞，使得神经干/前体细胞在进入下一次有丝分裂期之前获得时间进行自我修复。通过对53BP1 foci、ATM的磷酸化水平及γ-H2AX的检测，证实米诺环素的这种保护作用与DNA损伤修复无关。通过细胞流式技术，Cleaved-caspase 3、LC3等蛋白的检测，以及使用自噬抑制剂3-MA进一步确证了米诺环素可通过增加神经干细胞的自噬来抑制电离辐射所诱导的细胞凋亡。通过检测AMPKα1、AMPKα2、LC3 II蛋白、Cleaved-caspase 3表达和运用AMPK激活剂A769662、慢病毒shRNA感染细胞干扰技术，证实米诺环素通过激活AMPKα1介导的自噬通路来抑制电离辐射诱导的神经干/前体细胞凋亡。此外我们还发现特拉唑嗪对放射性认知损害亦有明显的防治作用。经过上述研究揭示：海马神经干/前体细胞中DDR和let-7b的交互作用对其受照射后增殖和分化具有调控作用。研究结果对阐明电离辐射造成海马神经发生障碍的机制具有重要参考，并对放射性认知损害的防治提供一定的指引。