Bmi1-p16信号轴通过抑制颗粒细胞衰老发挥延缓卵巢衰老的作用及机制研究

The aim of this project is to investigate the role and mechanism of Bmi1-p16 signal axis in delaying ovarian ageing by inhibiting cell senescence of granulosa. Firstly, we will detect the expression of molecules including Bmi1 and p16, and cell senescence in granulosa (obtained from patients who received in vitro fertilization treatment). Subsequently, Bmi1 deficient mice (Bmi1-/-) will be treated with the senolytic drug ABT-263 or doubly Bmi1 and p16 deficient mice will be generated to determine whether clearance of senescent cells or p16 deficiency will rescue the phenotype of Bmi1 deficiency-induced ovarian ageing. Female reproductive phenotype will be analyzed and compared with each other using histopathological, cellular and molecular techniques, including alterations of estrus cycle, serum hormone, ovarian size and weight, follicle numbers from each stage, oocyte fertilization and embryo development, cell proliferation and senescence of granulosa. Finally, granulosa from WT or Bmi1-/-mice will be cultured and analyzed using the techniques, including plasmid transfection, Co-Immunoprecipitation(Co-IP) and Chromatin Immunoprecipitation(CHIP) to determine how Bmi1 regulates the expression of p16 . This study will provide theoretical and experimental basis for delaying ovarian ageing by targeting cell senescence of granulosa (inhibiting cell senescence of granulosa or clearance of senescent granulosa).

本课题旨在研究Bmi1-p16信号轴通过抑制颗粒细胞衰老发挥延缓卵巢衰老的作用及机制。首先，我们在颗粒细胞临床标本中检测Bmi1、p16等分子表达及细胞衰老情况。继而，我们通过给予Bmi1-/-雌性小鼠衰老细胞清除药物ABT-263或建立Bmi1和p16双基因敲除小鼠，利用组织病理学、细胞生物学和分子生物学的方法，比较分析上述各组动物的雌性生殖表型差异，包括动情周期、血清中激素水平、卵巢大小和重量、各级卵泡数量、卵母细胞受精和胚胎发育、颗粒细胞增殖和衰老，以明确清除衰老颗粒细胞或敲除p16基因能否改善Bmi1缺失引起的卵巢衰老；最后，我们培养WT和Bmi1-/-小鼠颗粒细胞，利用质粒转染、免疫共沉淀及染色质免疫共沉淀等技术，探究颗粒细胞中Bmi1调节p16表达的具体分子机制。本研究将为靶向颗粒细胞衰老(抑制颗粒细胞衰老或清除衰老颗粒细胞)来延缓卵巢衰老、改善卵巢功能提供理论和实验依据。

本课题主要研究了Bmi1-p16信号轴通过抑制颗粒细胞衰老发挥延缓卵巢衰老的作用及机制。我们主要利用颗粒细胞临床标本、基因敲除小鼠以及体外培养的颗粒细胞，从临床标本、动物以及细胞水平对本课题进行了详细地研究。我们利用颗粒细胞临床标本证实，相较于年轻卵巢功能正常女性，高龄卵巢功能下降女性p16阳性或β-gal阳性颗粒细胞数目显著增加，而增殖颗粒细胞数目显著减少。给予Bmi1-/-小鼠予以衰老细胞清除药物ABT263补充，我们发现ABT263补充可以显著增加Bmi1-/-小鼠卵巢大小、促进卵巢颗粒细胞增殖、降低衰老的颗粒细胞数量并改善Bmi1-/-小鼠卵巢内的各级泡细胞数量。此外，我们还证实抗衰老药物吡咯喹啉醌(PQQ)补充可以显著改善烷化剂诱导的小鼠卵巢早衰表型。通过建立Bmi1和p16双基因敲除小鼠，我们发现敲除p16基因可以促进Bmi1-/-小鼠卵巢颗粒细胞增殖、抑制卵巢颗粒细胞衰老，并改善Bmi1-/-小鼠卵巢内的各级卵泡数量。然而，敲除p16基因并不能改善烷化剂诱导的小鼠卵巢早衰。这一结果提示，p16在不同原因引起的卵巢早衰中的作用并不一致。最后，我们利用培养的人颗粒细胞系KGN发现，敲低Bmi1或者Ring1B可以显著上调p16 mRNA的表达水平、降低p16启动子区域H2AK119ub富集水平而对p16启动子区域H3K27Me3水平并无明显影响。这一结果表明Bmi1主要通过修饰p16启动子区域H2AK119ub水平，从而调控p16基因表达。综上所述，本研究表明 Bmi1以PRC1依赖的方式通过增加p16启动子区域H2K119ub的水平进而抑制p16基因转录，通过抑制颗粒细胞衰老发挥防止卵巢早衰的作用，该研究为靶向颗粒细胞衰老（清除衰老颗粒细胞或者抗衰老药物）从而延缓卵巢衰老、改善卵巢功能提供理论和实验依据。