AKR1B10蛋白翻译后修饰在肝癌细胞脂代谢紊乱和化疗敏感性中的作用机制研究

AKR1B10 is a vital enzyme associated with lipogenesis, which is overexpressed in liver and other cancers and acts as an onco-protein. Previous studies indicated that EGF induced AKR1B10 expression through AP-1 signalling in hepatocellular carcinoma cells, collaborated with Insulin. However, the mechanism of AKR1B10 protein modification and the corresponding phenotypic alterations remain unclear. Of note, the insulin signalling was abnormally activated in tumorigenesis and multiple moleculars in this pathway play as protein kinases, which promote the phosphorylation of specific substrates and lead to phenotypic alterations. In this grant, we firstly intent to screen and identify the specific sites on AKR1B10 protein which can be phosphorylated. Secondly, we want to identify the kinase(s), which can interact with AKR1B10 protein and to further probe the potential mechanism in vitro and in vivo. Thirdly, the function of phosphorylated AKR1B10 protein will be investigated in hepatocarcinogenesis both in vitro and in vivo. Finally, we intend to probe whether the effect of chemotherapy on hepatocellular carcinoma cells can be improved through negatively regulating AKR1B10 function by specific inhibitor of the corresponding protein kinase or siRNA for AKR1B10. Taken together, this work may provide a novel approach and theoretical basis for the treatment of hepatocellular carcinoma through targeting AKR1B10.

AKR1B10是与脂代谢调控及细胞内毒物清除密切相关的重要调节酶，在肝细胞癌等多种肿瘤组织中表达上调，发挥癌蛋白的功能。前期工作显示EGF与胰岛素可通过AKR1B10上游调控区内AP-1结合元件参与该基因的表达调控，但其蛋白翻译后修饰机制及由此产生的功能改变尚不清楚。胰岛素信号通路在肿瘤发生过程中异常活跃，其中的多个信号分子本身即为蛋白激酶，可促进底物的磷酸化。我们推测AKR1B10蛋白可能作为胰岛素信号通路内蛋白激酶的底物被磷酸化而引起功能改变，影响肿瘤的生物学行为及其对化疗的反应。本研究拟通过生物信息学分析筛选并鉴定AKR1B10蛋白可被磷酸化修饰的位点，寻找与之相互作用的激酶，并在外源及内源水平加以验证；阐述磷酸化修饰对AKR1B10蛋白功能的影响及其在肝细胞癌发生、进展中的作用机制；探讨AKR1B10表达调控及翻译后修饰对肝癌细胞化疗敏感性的影响；从而为肝细胞癌的治疗提供理论依据。

AKR1B10是与脂代谢调控及细胞内毒物清除等功能密切相关的重要调节酶，在肝细胞癌等多种肿瘤组织中表达上调，发挥癌蛋白质的功能。在本项目研究中我们发现AKR1B10在肝癌细胞及组织中表达上调，细胞水平及动物水平的表型分析显示，敲减AKR1B10可以抑制肝癌细胞的增殖与移植瘤的生长。AKR1B10的表达上调与肝细胞癌患者预后的相关性分析显示，AKR1B10表达水平高的患者，接受化疗后复发率明显高于AKR1B10低表达的患者。后续蛋白质相互作用筛选显示多个可能参与AKR1B10功能调控的蛋白质，其中PLK1可参与其磷酸化修饰。在该项目支持下，我们建立了基于酵母双杂交的研究平台，系统筛选了多个与肝细胞癌、胰腺癌发生相关的蛋白复合物，其中NOP14在胰腺癌中表达上调，尤其在转移灶中表达上调更为明显，提示NOP14可能参与胰腺癌的转移调控。细胞水平的表型分析显示，抑制NOP14表达可以明显降低迁移的细胞数，皮下、原位及尾静脉裸鼠模型则证实了体外水平的研究结果。分子机制研究显示，NOP14与p53可能存在相互作用，但是该相互作用是NOP14蛋白与p53 mRNA之间的相互作用，并且NOP14的功能依赖于p53 mRNA是否存在位点突变。更为有趣的发现是，NOP14发挥癌基因的作用是在p53突变的胰腺癌细胞中，在表达野生型p53的细胞，如SW1990中，NOP14过表达可以抑制胰腺癌细胞的转移。为进一步揭示NOP14介导信号通路，我们在NOP14过表达和敲减的胰腺癌细胞PANC-1中进行了RNA二代测序，包括mRNA与microRNA测序。结果显示，包括p53等多个mRNA分子受到NOP14的调控，而miR-17-92 miRNA家族也受到NOP14的影响，其中miR-17-5p最为明显。已有研究显示，miR-17-92家族启动子区活性受到p53直接调控，我们在胰腺癌细胞中也验证了这一发现。靶基因分析显示，P21是miR-17-5p在胰腺癌细胞中的功能靶基因。综合上述研究，我们的结果显示，NOP14在p53突变的胰腺癌细胞中通过p53-miR-17-5p-P21通路发挥癌基因作用，提示NOP14可能是该类型胰腺癌的潜在治疗靶点。